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Sep 12, 2023

Cuantificación de la fijación biológica de nitrógeno por Mo

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 22011 (2022) Citar este artículo

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La fijación biológica de nitrógeno (BNF) por molibdeno canónico y isoformas de nitrogenasa complementarias de vanadio y hierro es la principal fuente natural de nitrógeno recién fijado. La comprensión de los controles sobre el ciclo global del nitrógeno requiere el conocimiento de la isoforma responsable de la BNF ambiental. El ensayo de reducción isotópica de acetileno (ISARA), que mide el fraccionamiento de isótopos estables de carbono (13C/12C) entre etileno y acetileno en ensayos de reducción de acetileno, es uno de los pocos métodos que pueden cuantificar flujos de BNF específicos de isoformas. La aplicación de ISARA clásica ha sido un desafío porque la actividad de BNF ambiental a menudo es demasiado baja para generar suficiente etileno para los análisis isotópicos. Aquí describimos un método de alta sensibilidad para medir el etileno δ13C mediante el acoplamiento en línea de la preconcentración de etileno a la cromatografía de gases-combustión-espectrometría de masas de relación de isótopos (EPCon-GC-C-IRMS). Los requisitos de etileno en muestras con 10 % v/v de acetileno se reducen de > 500 a ~ 20 ppmv (~ 2 ppmv con eliminación previa de acetileno fuera de línea). Para aumentar la solidez al reducir el error de calibración, los mutantes de Azotobacter vinelandii de isoforma de nitrogenasa simple y los ensayos de muestras ambientales se basan en una fuente común de acetileno para la producción de etileno. La aplicación del método ISARA (LISARA) de baja actividad de BNF a suelos con baja actividad de fijación de nitrógeno, hojarasca, madera podrida, criptógamas y termitas indica BNF complementario en la mayoría de los tipos de muestras, lo que requiere estudios adicionales de BNF específico de isoforma.

El nitrógeno (N) establece fundamentalmente los límites de la productividad biológica, lo que probablemente restringe las respuestas de los ecosistemas naturales al cambio ambiental global1,2,3. La fijación biológica de nitrógeno (BNF, por sus siglas en inglés), el proceso procariótico que convierte el dinitrógeno atmosférico (N2) en amoníaco, es el principal aporte biológico de nuevo N biodisponible para los presupuestos globales y regionales de N. Por lo tanto, desempeña una función biogeoquímica clave en diversos ecosistemas, incluidos los bosques tropicales, templados y de latitudes altas, los pastizales y matorrales montanos, así como los entornos bentónicos y de mar abierto4,5. La nitrogenasa, la metaloenzima responsable de la BNF, existe en tres isoformas primarias, caracterizadas por el metal de transición presente en el sitio activo: la nitrogenasa canónica y la 'alternativa', o más recientemente denominada 'complementaria' de vanadio (V) solo y hierro ( Nitrogenasas sólo Fe)6,7. Las nitrogenasas de solo V y Fe son independientes de Mo y contienen los metales traza de origen cortical más abundantes V y Fe en lugar de Mo8.

Determinar la contribución de las diferentes isoformas de nitrogenasa al BNF ambiental es fundamental para comprender los controles mecánicos en el ecosistema BNF, particularmente cómo los ciclos biogeoquímicos acoplados de macronutrientes y metales traza biológicamente activos responden a las perturbaciones antropogénicas. Debido a que los cálculos de la tasa de BNF basados ​​en métodos tradicionales (es decir, ensayos de reducción de acetileno y métodos de abundancia natural 15N/14N) son sensibles a la isoforma de nitrogenasa9,10,11, la atribución incorrecta de las isoformas de nitrogenasa activas en BNF puede alterar las estimaciones del presupuesto de N en tanto hasta un 50 %12,13, lo que influye en el estado y la gestión del N del ecosistema.

La especificidad del metal de los flujos de BNF ambientales ahora se puede evaluar con la aplicación de seguimiento de flujo específico de isoforma a través del Ensayo de reducción de acetileno isotópico (ISARA) y métodos de rendimiento de etano combinados con análisis de secuencias de genes de nitrogenasa6,12,13,14. Estos enfoques han identificado contribuciones significativas de nitrogenasas complementarias V y solo Fe al BNF no rizobiano en diversas muestras que van desde hojarasca de manglares templados de Everglade, sedimentos de marismas costeras templadas y cianolíquenes boreales12,13,15,16. Más recientemente, un estudio de cianolíquenes BNF a lo largo de un gradiente de nutrientes de bosque boreal de 600 km proporcionó la primera evidencia a escala de ecosistema del papel de la V-nitrogenasa en el mantenimiento de las entradas de BNF en condiciones limitadas de Mo13, validando una hipótesis sostenida durante mucho tiempo sobre el "respaldo". rol de las nitrogenasas complementarias sugerido originalmente por estudios de laboratorio17. Además, se han observado bajas proporciones de actividad reductora de acetileno a nitrógeno (es decir, proporciones R), sugestivas de BNF complementaria, para suelos templados9, musgo boreal11,18 y madera en descomposición19. Además, se han detectado genes de nitrogenasa complementarios y no caracterizados en mantillo de madera20, intestinos traseros de termitas21, suelo9, musgo22 y cianolíquenes23,24. Estos estudios, junto con la acumulación de ejemplos de BNF limitado por Mo en biomas de bosques boreales18,25,26, templados y tropicales27,28,29,30,31,32,33, sugieren que el BNF complementario e independiente de Mo podría desempeñar un papel global. Sin embargo, la cuantificación de las tasas de BNF independientes de Mo en muestras ambientales, que a menudo tienen una baja actividad de BNF, ha sido un desafío ya que el método más confiable para la atribución de BNF complementaria, ISARA12, requiere rendimientos de etileno mucho más altos que los que se observan normalmente (por ejemplo, suelo, musgo). , la hojarasca generalmente genera < 300 ppmv de etileno durante incubaciones de ensayo de reducción de acetileno de 1 a 2 días). Un estudio más amplio de BNF complementario y sus controles dentro de ecosistemas importantes requiere mejoras metodológicas de ISARA.

El método ISARA, basado en el ampliamente utilizado ensayo de reducción de acetileno (ARA) proxy para la actividad BNF, se basa en el fraccionamiento de isótopos estables de carbono 13C/12C de abundancia natural de la reducción de acetileno a etileno (13εAR = δ13Cacetileno – δ13Cetileno, donde δ13C (‰) = ( [(13C/12C)muestra/(13C/12C)estándar) − 1] × 1.000 ) para cuantificar la actividad de las diferentes isoenzimas nitrogenasas12. Las muestras de espacio de cabeza de las incubaciones de ARA se analizan mediante inyección manual en un espectrómetro de masas de cromatografía de gases-reactor de combustión-relación de isótopos (GC-C-IRMS, Fig. 1a). El etileno (C2H4) se separa de otros componentes en el espacio de cabeza [normalmente, dióxido de carbono (CO2), agua (H2O), metano (CH4) y acetileno (C2H2)] mediante cromatografía de gases, el reactor de combustión luego convierte el etileno en CO2, seguido por medición IRMS de la relación 13C/12C del CO2 producido, que es equivalente al 13C/12C del etileno. Un proceso similar produce el 13C/12C de acetileno. Varias limitaciones técnicas y dificultades están asociadas con los métodos tal como se implementan actualmente. En primer lugar, existe un equilibrio entre la sensibilidad analítica (es decir, la magnitud de la señal obtenida por unidad de concentración de etileno) y una buena separación cromatográfica de etileno (es decir, que produce picos nítidos y bien definidos que no se superponen con otros componentes del espacio de cabeza) necesaria para análisis precisos y reproducibles. Este fenómeno resulta principalmente de las condiciones de inyección de la muestra en el sistema (p. ej., volumen de inyección, tasa de flujo, proporción de "división" de la dilución en el inyector del GC). Las mediciones precisas de δ13Cetileno admiten volúmenes máximos de inyección de ~ 1 ml y, por lo tanto, requieren muestras que produzcan altas concentraciones de etileno en ARA (> 500 ppmv). En segundo lugar, las mediciones de acetileno (δ13Cacetileno) a menudo tienen grandes incertidumbres debido a los efectos de memoria y cola de pico, lo que requiere un acondicionamiento frecuente de la columna de GC (es decir, un breve aumento de la temperatura para eliminar el agua, el acetileno y cualquier otro analito acumulado en la columna) y la combustión. oxidaciones del reactor en las que se inyecta O2 puro en el reactor a alta temperatura para regenerar la capacidad oxidativa del reactor. Finalmente, las mediciones de isótopos de etileno y acetileno se calibran según la escala de referencia internacional de isótopos de carbono VPDB usando estándares de isótopos de metano porque no existen estándares de etileno con valores de δ13C rastreables por NIST. Las desviaciones en el comportamiento químico entre el estándar de metano y los analitos objetivo, etileno y acetileno, durante la separación cromatográfica y la combustión pueden generar sesgos durante la corrección de la deriva a lo largo y a lo largo de múltiples muestras compuestas de mediciones repetidas. Por lo tanto, el método ISARA clásico requiere relativamente mucho tiempo y se limita a muestras con alta actividad BNF.

Metodología analítica para la medición de δ13C de etileno en una matriz de fondo que contiene 10 % v/v de acetileno o sin acetileno basada en (a) métodos ISARA clásicos que involucran inyección directa12, (b) el sistema EPCon, que agrega pasos de preconcentración de etileno y eliminación de acetileno, y (c) una precipitación química opcional para eliminar el acetileno34 antes de cargar la muestra en EPCon. El desarrollo y esquema de EPCon está adaptado de Weigand et al.35. Abreviaturas: Ac – acetileno.

Aquí, describimos un método ISARA altamente sensible dirigido a muestras con baja actividad de fijación de nitrógeno (Baja actividad BNF ISARA, LISARA). Incluye mejoras instrumentales y metodológicas al método ISARA clásico que permiten la cuantificación precisa de tasas de BNF independientes de Mo en muestras de forma automatizada. El novedoso diseño analítico se basa en la interconexión de un sistema GC-C-IRMS comercialmente disponible que se utiliza en los análisis ISARA tradicionales con un sistema de preconcentración de gas de etileno en línea (EPCon) completamente automatizado y fabricado internamente, desarrollado por Weigand et al.35. El EPCon elimina el acetileno, un componente del espacio de cabeza con la mayor interferencia de pico con el etileno, y concentra el etileno en las muestras a niveles que permiten análisis de isótopos de alta precisión a nivel de partes por millón con poca interferencia analítica de moléculas no objetivo. En este método actualizado, los requisitos de muestras de ISARA se han reducido de ~ 500 ppmv de etileno a ~ 2 ppmv. Para reducir las incertidumbres basadas en la calibración, proponemos el uso de estándares de etileno internos derivados de microbios disponibles comercialmente, lo que elimina la necesidad de mediciones de acetileno y permite mejores comparaciones dentro y entre laboratorios. Para demostrar la aplicabilidad ambiental, usamos LISARA para estudiar BNF de baja actividad en termitas que se alimentan de madera, así como muestras de hojarasca, suelo, musgo, líquenes y madera en descomposición de los bosques suburbanos del noreste de EE. UU. Los resultados sugieren una actividad BNF complementaria significativa en diversas muestras.

Siguiendo el enfoque de inyección directa de ISARA12 clásico con algunas modificaciones, las muestras de ARA con alto rendimiento de etileno (> 500 ppmv) en acetileno al 10 % v/v se inyectaron manualmente en un Thermo Scientific Trace GC Ultra-Isolink con un Agilent HP-PLOT/ Columna de GC capilar Q (30 m, id = 0,32 mm, ft = 20 μm) y un reactor de combustión conectado a un espectrómetro de masas de relación de isótopos Thermo Scientific Delta V Plus (GC-C-IRMS; Fig. 1a). Las modificaciones incluyen el reemplazo de las férrulas de plata en el horno GC con férrulas de poliamida Valcon (polímero reforzado con grafito) para limitar los efectos de memoria del acetileno. El reactor de combustión se oxidó con oxígeno puro durante 1 h antes de cada ejecución y se realizaron oxidaciones de semillas breves (15 min) entre lotes de medición (es decir, se requerían cada ~ 6 a 8 inyecciones de etileno, ~ 4 a 6 inyecciones de acetileno) para regenerar la oxidación del reactor. capacidad y minimizar la deriva de los valores de δ13C. Consulte la Tabla complementaria S1a en línea para obtener configuraciones adicionales del instrumento.

Las muestras de ARA con < 500 ppmv de etileno se analizaron mediante un sistema de preconcentración de etileno desarrollado en base a Weigand et al.35 y fabricado internamente (EPCon, Fig. 1b). El EPCon es un sistema de preparación de gas en línea totalmente automatizado que utiliza una serie de válvulas sincronizadas con precisión, trampas criogénicas y un cromatógrafo de gases (GC) para eliminar los componentes de fondo (particularmente agua y acetileno) y concentrar el etileno antes de que se introduzca en el GC-C-IRMS. El EPCon se desarrolló a través de la modificación de un sistema interno similar diseñado por Weigand et al.35 para medir los isótopos de nitrógeno y oxígeno en agua de mar y nitrato en agua dulce35,36,37 y optimizado para la medición de baja concentración de etileno δ13C. Las diferencias con su predecesor directo35 incluyen la conexión directa entre la válvula 4 en el EPCon ("V4" en la Fig. 1) a la columna GC en el sistema comercial GC-C-IRMS, sin pasar por la cámara de inyección para eliminar los problemas asociados (p. ej., disminución de la sensibilidad, ensanchamiento del pico). Las velocidades de flujo, las presiones y los tiempos de válvulas y trampas se ajustaron para separar eficazmente el etileno y el acetileno de modo que el acetileno pudiera eliminarse de la corriente de analito y el etileno pudiera enfocarse criogénicamente en un volumen pequeño antes de introducirlo en el GC-C-IRMS. Consulte los Métodos complementarios S1 y la Tabla complementaria S1b-c en línea para obtener información y configuraciones detalladas del instrumento.

Para muestras ISARA con menos de ~ 20 ppmv de etileno, la separación completa de GC de acetileno y etileno dentro del sistema EPCon fue inalcanzable en las condiciones de trabajo de nuestro laboratorio debido al desequilibrio de masa extremo en los analitos. Antes del análisis EPCon δ13Cetileno de estas muestras, realizamos la eliminación de acetileno fuera de línea del espacio libre de la muestra mediante precipitación química de acetileno con nitrato de plata (AgNO3) en amoníaco, produciendo una sal de carburo de plata34 (Precipitación química, Fig. 1c). Se añadió solución amoniacal de AgNO3 (0,5 g de AgNO3 en 10 ml de agua) a cada muestra (0,5 ml de AgNO3/10 ml de espacio de cabeza que contenía acetileno al 10 % v/v). Una vez que se completó la reacción (~ 10 min), el espacio de cabeza de la muestra se transfirió a un vial de muestreador automático para el análisis EPCon (Fig. 1b), y la solución de sal de carburo restante se neutralizó (1 ml de HCl 5 N). La eliminación completa del acetileno se verificó analizándolo en un cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama (GC-FID). Estimamos la influencia de la precipitación química del acetileno en los valores de δ13Cetileno usando muestras de control hechas con 2000 ppmv de etileno (del tanque EY-4) ​​con y sin la adición de 10% v/v de acetileno (n = 3, Tabla 1). Dada la naturaleza altamente reactiva de la sal de carburo de plata producto de la precipitación cuando está seca, la precipitación de acetileno debe manejarse con mucho cuidado34 y solo se realizó según sea necesario en este estudio (p. ej., muestra de etileno < 20 ppmv).

Para garantizar la continuidad entre nuestros análisis de muestras dentro de las series y a largo plazo (entre series), utilizamos tanques de gas de etileno y acetileno disponibles comercialmente como estándares de tanques internos (etileno EY-4, EY-8, acetileno AY-1, AY-4, Tabla 1) para la corrección de la deriva y los controles diarios de control de calidad. Los estándares de control de calidad para probar el rendimiento de IRMS y EPCon se analizaron antes de cada lote de muestras que se analizaron. Todas las mediciones de δ13Cetileno producidas por el EPCon-GC-C-IRMS durante ciclos largos (~ 30 h) se corrigieron para la desviación en la respuesta instrumental a lo largo del tiempo en relación con el estándar de corrección de desviación (EY-4) ​​que se midió a intervalos uniformes a lo largo de los ciclos de muestra mediante interpolación lineal entre estándares de corrección de deriva. Se utilizó un segundo estándar (EY-8 o un lote separado de estándares EY-4) ​​para validar de forma independiente el proceso de corrección de deriva. Los datos de las inyecciones directas se procesaron de acuerdo con el método clásico descrito por Zhang et al., 201612 y no requirieron corrección de deriva debido a las frecuentes oxidaciones de semillas del reactor. Consulte la Tabla complementaria S2 en línea para ver los detalles de carga de muestras con la colocación de los estándares de control de calidad y los Datos complementarios S1 en línea para los cálculos de procesamiento de datos.

Para cada método de medición (es decir, inyección directa, EPCon y precipitación química + EPCon), determinamos la sensibilidad, el límite de cuantificación, el rango de linealidad, la repetibilidad intradiaria y la reproducibilidad dentro del laboratorio (como se define en Carter y Barwick, 201138) análisis del estándar interno principal del tanque de etileno (EY-4) ​​en diversas condiciones (Tabla 1). La sensibilidad se determinó por regresión lineal de la señal de masa 44 de respuesta de IRMS (área en voltios segundos [Vs]) relativa a la cantidad de etileno carbono (C) cargado (en nmols C). El rango de linealidad se definió por las cantidades más bajas y más altas de etileno C que podrían inyectarse directamente en el GC o cargarse en el muestreador automático EPCon para obtener una amplitud máxima de masa 44 de 1 a 6 V (rango analítico conservador típico). Las muestras se cargaron con un objetivo de ~ 2 V para la señal de masa 44. La repetibilidad (es decir, la variabilidad intradía) se estimó como el promedio de las desviaciones estándar para cada día durante 26 días para EPCon y 6 días para inyección directa. La reproducibilidad dentro del laboratorio se calculó utilizando la desviación estándar de las mediciones promedio de δ13C para cada día durante 26 días para EPCon y 6 días para inyección directa.

El límite de cuantificación (LOQ) se determinó en función de la concentración mínima de etileno (en ppmv) que se podía medir con cada método. El LOQ técnico, basado en estándares de etileno y muestras sin acetileno, está limitado por la amplitud de pico mínima aceptada (1 V para masa 44) y los volúmenes de carga máximos para cada método (inyección directa, 1 ml según lo limiten el inyector y la columna de GC). carga; EPCon y métodos de precipitación química, 20 ml según las limitaciones del volumen del vial del automuestreador). El LOQ metodológico para muestras con matriz al 10%, fijado por el volumen máximo de carga que evita sobrecargar el sistema con acetileno, es de 0,5 mL para acetileno y 1,5 mL para EPCon. El LOQ metodológico cuando se utilizó la precipitación química es ~ 2 ppmv, la concentración de muestra más baja antes de que la concentración de etileno de fondo transportada en el acetileno generado a partir de carburo de calcio sea mayor que el etileno de la reducción de acetileno de la muestra.

Los mutantes de Azotobacter vinelandii que utilizan solo Nitrogenasa Mo (mutante 'MoNase', cepa CA70.139) o solo Nitrogenasa V (mutante 'VNase', cepa CA11.7040) para la fijación de nitrógeno se cultivaron aeróbicamente a 30 °C en un medio Burks modificado12 ,41 con 100 nM a 1 µM de NaMoO4 (cepa CA70.1) o NaVO3 (cepa CA11.70). CA70.1 es un mutante por deleción de doble gen (ΔvnfDGK::spc, ΔanfHD70::kan) que expresa solo los genes nif (Mo-nitrogenasa). CA11.70 también es un mutante por deleción de doble gen (ΔnifHDK, ΔanfHD70::kan) que expresa solo los genes vnf (V-nitrogenasa). Se tomaron muestras de células de fase exponencial (OD620nm ~ 0,3–0,8) para iniciar los ensayos de reducción de acetileno. Consulte Métodos complementarios S2 en línea para obtener más detalles.

Descripción general de los métodos de escalamiento directos de δ13Cetileno y 13εAR (= δ13Cfuente de acetileno – δ13Cetileno) para convertir valores de δ13Cetileno de muestra en porcentaje de reducción de acetileno por V-nitrogenasa (%VNasa). En el método de escalado directo 1, se usa el mismo lote de fuente de acetileno en las incubaciones de ARA de mutantes de Azotobacter que expresan solo Mo o VNasa como para las muestras ambientales, lo que elimina la necesidad de medir la fuente de acetileno δ13C y permite calcular el % de VNasa basándose únicamente en δ13Cetileno . Siguiendo los métodos de escalado de 13εAR12, se pueden usar diferentes lotes de acetileno para ARA de muestra y calibración de nitrogenasa única (p. ej., mutante); Los valores medidos (método 2) o estimados (método 3) de ẟ13Cfuente de acetileno junto con δ13Cetileno medido para cada lote de ARA se utilizan para calcular los valores de 13εAR, que luego se convierten en %VNasa en comparación con 13εMo y 13εv. Consulte la sección Método anterior y los Métodos complementarios S5 en línea para obtener detalles de la ecuación.

Se evaluó la actividad nitrogenasa complementaria en muestras de superficies naturales (musgo, cianolíquenes, hojarasca, tierra vegetal, madera en descomposición) y termitas que se alimentan de madera con baja actividad de BNF. Se recolectaron muestras de sitios boscosos en el centro de Nueva Jersey (Instituto de Estudios Avanzados, Reserva Stony Ford, Pine Barrens, Watershed Institute) y New Hampshire (Mount Moosilauke) de 2019 a 2021. En cada sitio, se recolectaron triplicados de cada tipo de muestra de una o más estaciones (10 m × 10 m por estación separadas por 500–1000 m). Las muestras, almacenadas a temperatura ambiente, fueron evaluadas por ARA dentro de los 5 días posteriores a la recolección. Las termitas que se alimentan de madera (género Zootermopsis) se obtuvieron de Ward Scientific (https://www.wardsci.com) y se mantuvieron en hábitats de laboratorio controlados durante 2 a 16 días antes de ARA. Consulte los Métodos complementarios S3 y la Tabla complementaria S3 en línea para obtener más detalles.

Se realizaron ensayos de reducción de acetileno42 (ARA) en cultivos de Azotobacter y muestras ambientales utilizando acetileno al 10 % v/v generado a partir de carburo de calcio. La concentración de etileno en el espacio de cabeza se controló mediante GC-FID. Consulte los Métodos complementarios S2, S3 y la Tabla complementaria S3 en línea para obtener detalles de ARA.

Los ARA de Azotobacter se realizaron a 30 °C, 200–250 rpm con agitación en frascos de suero de 25–240 ml sellados con tapones de butilo azul de 20 mm (Bellco), que contenían 10 % en volumen de cultivo celular y una composición de espacio de cabeza inicial de 90 % v/ v aire y 10% v/v acetileno. El gas del espacio de cabeza se transfirió a viales de suero evacuados (10 ml) con tapones de butilo azul de 20 mm (Bellco) para guardarlos para un análisis IRMS posterior una vez que las concentraciones de etileno del espacio de cabeza alcanzaron 100–2200 ppmv (cepa MoNase, generalmente dentro de las 4 h de incubación) y 50 –200 ppmv (cepa VNase, dentro de las 6 h de incubación), lo que produce patrones de escala de etileno internos EY-Mo-1 y EY-V-1 (Tabla 1, Fig. 2).

Los ARA de muestras de campo se realizaron en frascos de conservas de vidrio de 100 a 500 ml (Mason, Ball) con tapas de metal equipadas con tapones de butilo azul de 20 mm (hojarasca, suelo y madera, Tabla complementaria S3); en viales de vidrio de 30 ml con tapones de rosca equipados con septos de PTFE/silicona (musgo, líquenes, tierra, Tabla complementaria S3); o en viales de suero de 15 ml sellados con tapones de butilo de 20 mm (termitas, Tabla complementaria S3). Se realizaron incubaciones de control (sin acetileno agregado) con hojarasca, suelo, madera en descomposición (Mt. Moosilauke, Pine Barrens), musgo y líquenes (Mt. Moosilauke) y muestras de termitas para evaluar la producción endógena natural de etileno independientemente de la reducción de acetileno. Los tiempos de incubación de ARA para muestras ambientales variaron de ~ 2 a 300 h (Tabla complementaria S3) según la tasa de producción de etileno, con el objetivo de obtener al menos 20 ppmv de etileno. Los pesos de las muestras para las incubaciones de ARA variaron debido a la disponibilidad de muestras y la tasa de producción de etileno estimada, y se enumeran para cada ubicación y tipo de muestra en la Tabla complementaria S3. El espacio de cabeza de ARA se submuestreó (≤ 3 ml) para medir la concentración de etileno mediante GC-FID, y el espacio de cabeza restante se transfirió a viales sellados al vacío (10 ml) para un análisis isotópico posterior.

Debido a la baja actividad de BNF, el δ13Cetileno se corrigió por la influencia isotópica del etileno de fondo (~ 2 ppmv) transferido a los ARA por una fuente de acetileno al 10 % v/v (consulte Métodos complementarios S4, Eqn. S1 en línea). Se requirió una corrección de fondo para las muestras de ARA que producían < 20 ppmv de etileno; no se pudo derivar información cuantitativa sobre la nitrogenasa de muestras que producen < 5 ppmv de etileno debido a la influencia isotópica del etileno de fondo. Para los ARA que producen etileno > 5000 ppmv (es decir, 5 % de la concentración de acetileno), también se corrigió el δ13Cetileno para el fraccionamiento de Rayleigh12,43.

Se usó uno de los tres métodos (Fig. 2) para cuantificar la contribución de la nitrogenasa complementaria a la reducción de acetileno (como %VNasa o %FeNasa) en ARA usando δ13Cetileno y δ13Cacetileno. El método de escala utilizado dependía de si se podían lograr mediciones precisas de los valores de δ13Cacetileno de la fuente, dada la disponibilidad de la muestra y las dificultades técnicas en la cromatografía y la combustión. Se usó EPCon-GC-IRMS para medir δ13Cetileno. Todas las mediciones de δ13Cacetileno se realizaron utilizando el método de inyección directa. Consulte los métodos complementarios S5, la tabla complementaria S4 y los datos complementarios S1 en línea para obtener detalles de cálculo ampliados.

Método 1: se usó el enfoque de escalado directo (Fig. 2), que evita la necesidad de medir δ13Cacetileno, para calcular la contribución de nitrogenasa complementaria cuando se usó la misma fuente de stock de acetileno en ARA de muestras ambientales como un conjunto de ARA de calibración realizados con MoNase y cepas VNase de Azotobacter vinelandii. El δ13Cetileno medido en ARA de muestras ambientales se convierte en % de VNasa usando los valores de δ13Cetileno del miembro final (p. ej., estándares de escala de etileno, Tabla 1, Fig. 2) diagnóstico de 0 % y 100 % de actividad de VNasa generada, respectivamente, por los ARA de calibración de MoNase y VNase Azotobacter ( Consulte Métodos complementarios, S4, ecuación S3 en línea). Consulte los Métodos complementarios S2 en línea para obtener detalles sobre la configuración y los análisis de los ARA de Azotobacter.

Cuando la reserva de acetileno de origen utilizada en los ARA de muestra no se procesó en los ARA de calibración de Azotobacter, cuantificamos la contribución de nitrogenasa complementaria utilizando los enfoques clásicos de ISARA12 (Fig. 2, métodos 2 y 3), que requieren el conocimiento tanto del δ13Cetileno como del δ13Cetileno de la muestra para tener en cuenta la variación isotópica. en diferentes stocks de acetileno en cálculos de 13εAR (= δ13Cacetileno – δ13Cetileno).

Método 2: el δ13Cetileno de diferentes stocks de acetileno utilizados en la muestra y los ARA de Azotobacter, medido con el método de inyección directa, se utilizó con la muestra de δ13Cetileno para calcular el 13εAR, seguido de la calibración a la escala de %VNasa utilizando 13εV y 13εMo de Azotobacter y otros diazótrofos. Rhodopseudomonas palustris y Anabaena variabilis (Fig. 2, Métodos complementarios S5, Tabla complementaria S4, Datos complementarios S1; cálculo modificado de Zhang et al., 201612).

Método 3: cuando la medición precisa de δ13Cacetileno por inyección directa para el stock específico de acetileno dentro de un ARA fue inalcanzable, usamos la media y la desviación estándar de δ13Cacetileno para siete lotes diferentes de acetileno generados a partir de carburo de calcio durante los últimos 4 años (δ13Cacetileno = 14,9 ± 0,9 ‰, n = 8, figura complementaria S1, ecuación S5) en cálculos de 13εAR. El % de VNase se calculó utilizando valores de 13εV y 13εMo de Azotobacter y otros diazótrofos como en el método 2 (Fig. 2, Métodos complementarios S5, Tabla complementaria S4, Datos complementarios S1).

El crecimiento inestable de la cepa nitrogenasa solo Fe de A. vinelandii (RP1.1144, mutante 'FeNase') impidió los cálculos del % FeNase basados ​​en Azotobacter. Los cálculos %FeNase (Fig. 2, Método complementario S5, Tabla S4, Datos S1) utilizaron 13εFe = 5.2 ± 0.7‰ (sd) derivado de EPCon de Rhodopseudomonas palustris usando solo FeNase12 en ARA. Debido a que 13εFe < 13εV < 13εMo12, una actividad significativa de FeNase puede generar valores de %VNase > 100 % (es decir, 100 % de FeNase equivale a ~ 140 % de VNase; Tabla complementaria S4). La incertidumbre estimada en la escala %FeNase es como máximo ~ 20%.

Las contribuciones de nitrogenasa complementaria a la fijación de N2 y las tasas de fijación de N2 total ajustadas por isoforma se pueden calcular usando la contribución de %VNase o %FeNase a AR (ver arriba) y las proporciones R que especifican la tasa de fijación de AR a N2 para cada nitrogenasa (p. ej., RMoNase = 4, RVNasa = 2, RFeNasa = 0,5)12.

La sensibilidad de medición de δ13Cetileno por GC-C-IRMS es aproximadamente 40 veces mayor con la adición del periférico EPCon que con la inyección directa (4,3 frente a 0,1 frente a nmolC−1, Tabla 1).

Al eliminar el acetileno y condensar el etileno antes de la introducción en la columna en el GC-C-IRMS, el sistema EPCon-GC-C-IRMS produce mediciones confiables de δ13Cetileno con tan solo 1,1 nmol C de etileno, mientras que el método de inyección directa requiere > 23,6 nmol C. El mayor volumen permitido del inyector automático EPCon (20 ml) en relación con el puerto de entrada de muestra GC-C-IRMS (≤ 1 ml) y la mayor sensibilidad permiten la medición de gases con ≥ 0,7 ppmv de etileno en ausencia de acetileno de fondo. La concentración mínima de etileno para muestras con un fondo de 10 % v/v de acetileno (muestras típicas de ARA) es de 9 ppmv o 2 ppmv si el fondo de acetileno se elimina mediante precipitación química antes de los análisis EPCon. De manera conservadora, las concentraciones mínimas de trabajo de etileno para muestras de ARA son 500 ppmv (inyección directa), 20 ppmv (EPCon-GC-C-IRMS) y 5 ppmv (precipitación química + EPCon-GC-C-IRMS). La menor sensibilidad del método de inyección directa GC-C-IRMS se debe en parte al uso necesario de una alta relación de división dentro del puerto del inyector de muestra (40:1: la proporción del flujo de gas portador de muestra y He que se ventila desde el puerto de inyección en relación con la proporción que ingresa a la columna de GC) para resolver completamente los picos de etileno (~ unos pocos a varios cientos de ppmv) y acetileno (~ 100,000 ppmv) con nuestra columna de GC capilar.

Usamos etileno de tanque con composiciones constantes de δ13C como estándares internos en el transcurso de corridas de ~ 30 h (~ 75 muestras y ~ 45 controles de calidad, configuración de corrida típica en la Tabla complementaria S2 en línea) para correcciones de deriva intradía (2–4 ‰ -rango; Figura complementaria S3) causado por el envejecimiento del reactor con el tiempo (sin oxidaciones frecuentes de semillas), lo que garantiza la comparabilidad de los resultados durante varios días (sd a largo plazo = 0,2 ‰, Tabla 1). La repetibilidad y la reproducibilidad dentro del laboratorio de δ13Cetileno del tanque EY-4 son similares para los métodos de inyección directa y EPCon-GC-C-IRMS (repetibilidad 0,11‰ y 0,20‰; reproducibilidad 0,27‰ y 0,17‰, respectivamente). Además de la alta reproducibilidad de δ13Cetileno del sistema EPCon, los valores de δ13Cetileno obtenidos por EPCon y los métodos de inyección directa para todos los estándares de etileno estaban en buena concordancia (Tabla 1). Llegamos a la conclusión de que el sistema EPCon no introduce un sesgo sustancial en la precisión de los resultados, y los datos de EPCon son directamente comparables con los resultados publicados obtenidos utilizando métodos de inyección directa12,13,15,16.

Se identificaron varias fuentes de incertidumbre y sesgo para las mediciones de δ13C de etileno y acetileno utilizando estándares de tanque. A veces, la integración automática propuesta por el software subestimaba el valor esperado de δ13C del estándar, probablemente debido a una acumulación sustancial de 13C en relación con el 12C vinculado al reactor de combustión (Fig. S3 complementaria). Este fenómeno fue más pronunciado con los análisis de δ13Cacetileno, posiblemente debido a interacciones más fuertes entre el acetileno y los metales del reactor de combustión (CuO, NiO, Pt), así como la propia columna de GC. El exceso de acetileno (es decir, la amplitud máxima de la masa 44 > 5 V) aparente durante los análisis de δ13Cetileno exacerbó los problemas de picos de cola, lo que provocó una disminución de la precisión de δ13Cetileno (hasta en un 5‰). Era necesario reacondicionar la columna de GC y el reactor de combustión cuando se introducía inadvertidamente un exceso de acetileno en el GC-C-IRMS (p. ej., ventilación incompleta dentro de EPCon).

Probamos las interferencias de diferentes gases comúnmente presentes en muestras ambientales y de gases de fondo generados durante ARA. El sistema EPCon elimina con éxito la mayoría de los gases de fondo (aire/N2, CH4, CO2, acetileno) y minimiza sus interferencias máximas con el etileno (Tabla 1). Solo el etano, producido a < 3% de la tasa de etileno por nitrogenasa en ARAs12,14, es retenido por el EPCon, pero su interferencia isotópica con el etileno es mínima ya que los picos de etano y etileno están bien separados en el GC-C-IRMS .

La medición de δ13Cetileno por EPCon-GC-C-IRMS y δ13Cacetileno por inyección directa GC-C-IRMS para muestras de ARA forma la base del método de ensayo de reducción de acetileno isotópico de baja actividad BNF (LISARA). Aplicamos LISARA a diversas muestras ambientales (suelo, hojarasca, madera en descomposición, musgo y cianolíquenes de sitios en el noreste de EE. UU. y termitas que se alimentan de madera criadas en laboratorio) con una amplia gama de rendimientos de etileno en ARA (5–1000 ppmv) . Se utilizó uno (o más) de los tres métodos de cálculo (Fig. 2) para obtener las contribuciones de %VNase (o %FeNase) a la reducción de acetileno (AR; métodos 1, 2, 3, Figs. 2 y 3).

El método ISARA clásico12 utiliza 13εAR, el fraccionamiento de isótopos estables de carbono debido a la reducción de acetileno en ARA (es decir, δ13Cacetileno– δ13Cetileno) y valores diagnósticos de 13εAR para AR por cada isoforma de nitrogenasa (13εMo, 13εV y 13εFe, Tabla complementaria S4) para determinar %VNase o %FeNase (Figs. 2 y 3). Para eludir la medición de acetileno δ13C, que tiene incertidumbres típicas de 3 a 4 veces más altas que las del etileno (Tabla 1) y a menudo se retiene en el sistema para requerir un reacondicionamiento frecuente de GC-C, desarrollamos un enfoque de escalado directo para calcular la contribución de nitrogenasa complementaria basada únicamente en δ13Cetileno (Fig. 2, método 1). Esto se logra comparando el δ13Cetileno generado a partir de una fuente común de stock de acetileno utilizada dentro de los ARA de muestras ambientales (δ13Cmuestra) y conjuntos de ARA de calibración isotópica realizados con cepas de MoNase y VNase de Azotobacter vinelandii (δ13CMo y δ13CV, Fig. 2, Métodos complementarios S5) . No pudimos determinar los valores de δ13CFe para los cálculos de % FeNase con A. vinelandii mediante enfoques de escalado directo ya que el crecimiento de la cepa FeNase RP1.1144 era inestable.

Idealmente, todos los valores de isótopos de las muestras se escalarían al % de nitrogenasa complementaria usando el método 1, el enfoque de escalado directo porque está asociado con la menor cantidad de incertidumbre. Los métodos 2 y 3, aplicados a muestras que se analizaron antes de que se desarrollaran los estándares de escala directa y los protocolos asociados, también se pueden usar en casos en los que no se pudieron completar los procedimientos de escala directa (p. ej., acetileno insuficiente, experimentos fallidos con Azotobacter ARA). Si bien el método 3 está asociado con la incertidumbre más alta, proporciona los medios más rápidos para estimar la contribución de las nitrogenasas complementarias al BNF.

Con la excepción de los cianolíquenes, todos los tipos de muestras exhibieron una señal isotópica consistente con la actividad nitrogenasa complementaria (Fig. 3, estadísticas resumidas en la leyenda, tenga en cuenta que el 140 % de VNase es equivalente al 100 % de FeNase, consulte Métodos arriba). Las contribuciones potenciales de nitrogenasa complementaria a AR en muestras de hojarasca y musgo variaron de 0 a 100 % de VNase, con la excepción de una muestra de hojarasca con 195 % de VNase. Las contribuciones potenciales en madera en descomposición y termitas variaron de 40 a 160% de VNasa. Los datos del suelo también son muy variables, oscilando entre el 30 y el 180 % de VNasa. Algunas de las 114 muestras analizadas son valores atípicos con más de ~ 200 % de VNase (1 musgo, 2 muestras de suelo, datos que no se muestran en la Fig. 3), que atribuimos al fraccionamiento isotópico del gas debido a la fuga del tapón.

La incertidumbre estimada para las contribuciones del %VNasa a AR para muestras ambientales cuantificadas por escalado directo de los valores de δ13Cetileno es más baja que las incertidumbres de los métodos basados ​​en 13εAR: ~ 9 % para el método 1 de escalado directo, ~ 15 % para el método 2 de 13εAR, ~ 20 % para Método 3 de 13εAR (Fig. 3, Método complementario S5; Datos complementarios S1). La mayor precisión obtenida escalando directamente δ13Cetileno a %VNasa (método 1) evita la incertidumbre asociada con las mediciones de δ13Cacetileno. Esto es evidente en la Fig. 3, donde los valores de %VNase para los mutantes de nitrogenasa individuales (es decir, los valores de Av MoNase y Av VNase en la Fig. 3) están agrupados de forma más estrecha para el método 1 (utiliza el escalado directo de los valores de δ13Cetileno de la muestra y del mutante). ) que los de los métodos 2 y 3 (usa valores explícitos de 13εAR). La mayoría de las atribuciones de nitrogenasa complementaria para ARA de cultivo de nitrogenasa único se agrupan dentro del 15 % de sus valores esperados (es decir, 0 % de VNase para la cepa de A. vinelandii MoNase, 100 % de VNase para la cepa de A. vinelandii VNase, 100 % de FeNase = 140 % de VNase para R. palustris FeNase), sin embargo, algunas muestras muestran ~ 20–30 % de errores (p. ej., ~ 130 % de VNase para la cepa de A. vinelandii VNase, ~ − 20 % de VNase para la cepa de A. vinelandii MoNase). Las incertidumbres para el % de FeNasa cuantificado con 13εAR y 13εFe de Rhodopseudomonas palustris FeNase son ~ 15–20 % (Método complementario S6, Datos complementarios S1). Por lo tanto, las muestras que requieren la máxima precisión (actividad BNF muy baja) para la cuantificación de la contribución de nitrogenasa complementaria deben utilizar el método de escalado directo basado en δ13Cetileno (método 1).

Contribución de la nitrogenasa complementaria a la reducción de acetileno (como %VNase o %FeNase) dentro de los ARA en muestras ambientales con baja actividad de BNF y nitrogenasa única que utiliza cultivos diazótrofos. Estadísticas de resumen de muestra (promedio ± sd %VNase, rango %VNase, n.º de muestras): hojarasca (32,4 % ± 45,4 %, − 19,9 a 195,4 %, 30), líquenes (− 0,8 % ± 4,7 %, − 8,9 a 5,6 %, 6), musgo (65,3 % ± 37,9 %, − 14,5 a 123,0 %, 31), suelo (123,9 % ± 37,2 %, 25,4 a 177,8 %, 21), termitas (130,1 % ± 22,0 %, 104,8 a 156,6 % , 7) y Madera en descomposición (125,9% ± 32,6%, 40,6 a 167,6%, 43). Las abreviaturas son las siguientes: Av MoNase: cepa de Azotobacter vinelandii MoNase, Av VNase: cepa de A. vinelandii VNase y Rp FeNase: cepa de Rhodopseudomonas palustris FeNase. Consulte los métodos complementarios S5 y S6 y los datos complementarios S1 en línea para obtener detalles sobre los cálculos de escala e incertidumbre.

Dadas las incertidumbres, las muestras de ARA con > 160 % en la escala de %VNasa y > 120 % en la escala de %FeNasa deben estar fuertemente influenciadas por procesos no relacionados con la BNF (p. ej., ciclo endógeno natural del etileno: producción o consumo, fuga de gas de los tapones). El fraccionamiento no relacionado con BNF puede explicar los valores de VNasa > 160% observados para ciertas muestras de hojarasca (n = 1), musgo (n = 1), suelo (n = 4), madera podrida (n = 2).

La mayor sensibilidad en el sistema EPCon-GC-C-IRMS en comparación con GC-C-IRMS (Tabla 1) da como resultado unos requisitos de etileno de la muestra entre 120 y 450 veces menores (dependiendo de si el acetileno también está presente en la muestra, Tabla 1). Es importante destacar que los análisis EPCon de las muestras de ARA dan como resultado una exposición limitada de la columna de GC y el reactor de combustión al acetileno en las muestras de ARA, lo que provoca una desviación sustancial en los resultados analíticos debido a la degradación del acetileno en el rendimiento de la columna de GC y del reactor. En combinación con las correcciones de deriva intradiarias basadas en el gas del tanque con un δ13C constante, el uso del sistema EPCon produce resultados más reproducibles, limita el número de oxidaciones del reactor y prolonga la vida útil del reactor y de la columna de GC capilar, lo que reduce el tiempo y la duración. -costo a plazo por análisis IRMS. Además, todas estas mejoras instrumentales y analíticas garantizan resultados comparables con concentraciones de etileno mucho más bajas en experimentos y ejecuciones analíticas, sin comprometer la reproducibilidad. Como resultado, se pueden lograr 120 mediciones de δ13Cetileno de manera automatizada durante una ejecución de 30 horas en el sistema EPCon en comparación con los 7 a 10 días de trabajo a tiempo completo para una persona que usa inyección directa en el GC-C-IRMS.

El método LISARA es una mejora analítica clave necesaria para los estudios de fijación de nitrógeno por nitrogenasas complementarias en el medio ambiente global. La actualización analítica EPCon-GC-C-IRMS permite la caracterización isotópica fiable y reproducible del etileno en muestras de ARA en prácticamente cualquier concentración de etileno. En la práctica, las muestras con tan solo 20 ppmv de etileno se pueden medir de forma rutinaria antes de que se alcance la capacidad de eliminación de acetileno del EPCon (Fig. 1). Las muestras de ARA de muy bajo rendimiento (5–20 ppmv de etileno) también se pueden medir con el sistema EPCon después de la eliminación completa del acetileno del espacio de cabeza mediante precipitación química (consulte la sección Métodos). Sin embargo, la presencia de etileno de fondo arrastrado en el acetileno utilizado para los ARA y la posible producción de etileno endógeno natural (es decir, no asociado con BNF) puede afectar los valores de δ13Cetileno, lo que complica las interpretaciones de la contribución de la nitrogenasa complementaria en muestras de actividad BNF muy baja evaluadas con LISARA.

El desarrollo de un enfoque de escalado directo para calcular las contribuciones de nitrogenasa complementaria basado únicamente en el δ13Cetileno de los análisis de LISARA evita varias limitaciones asociadas con el ISARA tradicional, como la necesidad de concentraciones de etileno > 500 ppmv y el requisito de mediciones de δ13Cacetileno. Además, el paso de precipitación fuera de línea para eliminar por completo el acetileno del espacio de cabeza de la muestra de ARA permitiría que cualquier laboratorio de microbiología o química húmeda subcontrate los análisis ISARA de etileno de la muestra y los ARA de calibración de nitrogenasa individuales se ejecutan con la misma fuente de acetileno a otros laboratorios analíticos de isótopos estables para δ13Cetileno mediciones. Observamos que la comparabilidad de los valores absolutos de δ13C entre los grupos de investigación puede variar y ser difícil de evaluar, ya que varios factores (p. ej., el tipo de columna de GC y el estado del reactor de oxidación) pueden influir en los valores absolutos de δ13C. Esto hace que los análisis simultáneos de ARA de calibración de nitrogenasa única y muestras ambientales sean particularmente importantes.

Aparte de los estudios de nitrogenasa complementaria, el sistema EPCon también tiene aplicaciones en otros campos, incluida la biología vegetal. Por ejemplo, el análisis EPCon de la composición isotópica del etileno producido endógenamente (por ejemplo, por bacterias del suelo y plantas), una fitohormona involucrada en la respuesta al estrés y la germinación de semillas45, podría ayudar a identificar sus fuentes y rastrear su ciclo en entornos de suelo complejos.

De las diversas muestras terrestres caracterizadas usando LISARA, 5 de los 6 tipos de muestras exhibieron valores de δ13Cetileno consistentes con alguna contribución de la nitrogenasa complementaria a la actividad de BNF (Fig. 3). Estos resultados se suman a la creciente evidencia que sugiere una actividad nitrogenasa complementaria generalizada en los ecosistemas terrestres. A diferencia de un estudio anterior sobre la especie de cianolíquenes Peltigera en los bosques boreales, que reveló altos niveles de actividad de nitrogenasa complementaria13, no encontramos evidencia de actividad de VNase en muestras del mismo género recolectadas en el noreste templado de EE. UU. (Fig. 3, líquenes). Se ha descubierto que la actividad nitrogenasa complementaria en este género de cianolíquenes está controlada principalmente por la cantidad de molibdeno en los talos de liquen (contenido de talos de Mo < 300 µgMo.gdry_liquen−1)13, que refleja la deposición atmosférica. La mayor tasa de deposición atmosférica de Mo en el noreste templado de EE. UU.46 puede proporcionar suficiente Mo a estas muestras de líquenes para obviar la necesidad de nitrogenasa BNF complementaria.

La actividad consistente de nitrogenasa complementaria observada aquí para la hojarasca del noreste, el suelo, las muestras de madera en descomposición y para las termitas que se alimentan de madera probablemente refleja controles de Mo diferentes y más complejos en BNF que en los cianolíquenes y el musgo, que están más directamente conectados con la deposición atmosférica rica en Mo. . Es probable que existan diferencias en los requisitos de Mo entre los diazotrofos, lo que posiblemente refleje variaciones en las estrategias de manejo de metales a nivel de organismo47 y en las propiedades fisicoquímicas de los entornos alrededor de las células diazotrofas, que pueden modular la biodisponibilidad de Mo. Por ejemplo, niveles más altos de ciertas formas de materia orgánica con una fuerte capacidad de unión a Mo (fracciones de catecol) en las muestras48 podrían dar como resultado mayores requisitos totales de Mo para Mo BNF, lo que influye en las relaciones de Mo y nitrogenasa complementaria en las muestras49. Colectivamente, nuestros resultados resaltan la necesidad de estudios más detallados sobre BNF complementario y sus controles en muchos tipos de muestras comunes.

La presencia de etileno de fondo en la fuente de acetileno (~ 2 ppmv de etileno por 10 % v/v de acetileno de carburo de calcio) sigue siendo un desafío al cuantificar la nitrogenasa complementaria en muestras ambientales con muy baja actividad (< 20 ppmv de etileno generado en ARA). Si bien la señal isotópica del etileno de fondo en la fuente de acetileno se puede determinar fácilmente utilizando los métodos EPCon actuales, existe una variabilidad significativa (8,4 ± 1,9 ‰, n = 8 lotes de acetileno). Las correcciones isotópicas para el etileno de fondo no dan lugar a una gran pérdida de precisión y exactitud dentro de los ARA que contienen un rendimiento de etileno de 10 a 20 ppmv, pero darían lugar a un gran aumento de la incertidumbre para las muestras con etileno < 10 ppmv. Por lo tanto, el método LISARA solo puede proporcionar información cualitativa sobre la nitrogenasa complementaria para muestras con 2–5 ppmv de etileno.

Al sondear muestras ambientales, el ciclo natural del etileno endógeno por las bacterias del suelo y las plantas también puede interferir con la cuantificación de la contribución de la nitrogenasa complementaria (ver Hendrickson 198950 y las referencias allí). Debido a que las condiciones de bajo oxígeno favorecen la producción de etileno e inhiben la oxidación de etileno50, es probable que las incubaciones prolongadas aumenten este fenómeno. En este estudio, observamos una producción endógena significativa de etileno (es decir, > 5 % de la concentración de etileno producido por ARA para un tipo de muestra y una ubicación determinados) en 12 de 93 muestras de control "sin acetileno añadido". Las 12 muestras que contenían etileno endógeno se incubaron durante 290 a 300 h (27 muestras se incubaron durante ese tiempo). Otro lote de 27 muestras incubadas durante 165 a 175 h no mostró signos de producción endógena de etileno. Se ha informado que el acetileno inhibe la oxidación del etileno, por lo que las muestras de control "sin acetileno agregado" podrían no ser suficientes para evaluar la producción endógena de etileno en ARA con un rendimiento de etileno muy bajo (< 20 ppmv)50. Por lo tanto, recomendamos incubar las muestras idealmente durante menos de 60 h al realizar estudios ISARA o LISARA. En general, la baja tasa de producción endógena de etileno de nuestras muestras durante las incubaciones (Tabla complementaria S3) y la similitud entre las firmas isotópicas obtenidas para cada tipo de muestra en cuatro sitios, 2 años y varios tiempos de incubación (2-300 h) indica que el ciclo del etileno tiene una influencia mínima en los resultados informados.

Nuestro procedimiento y metodología analíticos actualizados ahora permiten la investigación de la contribución y los controles ambientales de la nitrogenasa complementaria en la mayoría de las muestras fijadoras de N2, a pesar de las limitaciones restantes en el análisis LISARA de muestras de etileno de muy bajo rendimiento de ARA. El método LISARA disminuye la incertidumbre y el sesgo asociados con las mediciones de acetileno y permite un uso más amplio de la metodología ISARA con cultivos puros y organismos de alto rendimiento. Finalmente, nuestro estudio de tipos de muestras comunes en varios ecosistemas templados del noreste de los EE. UU. proporciona más evidencia de la importancia ecológica de la nitrogenasa complementaria para el ciclo del nitrógeno y los metales traza en los ecosistemas terrestres. Las diferencias específicas de la muestra en la contribución, como lo sugieren nuestros resultados, requieren más investigación sobre los controles de la nitrogenasa específica de la isoenzima en entornos naturales.

Todos los datos presentados aquí se pueden encontrar en línea en la Información complementaria 1 (incluye los métodos S1–S6; las figuras S1–S3; las tablas S1–S5) y los datos complementarios S1.

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Descargar referencias

Agradecemos el apoyo financiero de Watershed Institute (https://thewatershed.org), Carbon Mitigation Initiative (Princeton High Meadows Environmental Institute a XZ), Tuttle Fund (Princeton Geoscience Department a XZ), NSF EAR grant 1631814 (a XZ), y una beca posdoctoral de investigación en ciencias biológicas de la Fundación Simons (para RD). Agradecemos a los colaboradores del instituto Watershed, la estación de campo Rutgers Pineland, el Centro de Estudios Ecológicos Stony Ford de la Universidad de Princeton, el Instituto de Estudios Avanzados y el Dartmouth College-Mt. Comité Asesor de Moosilauke por el permiso y el acceso a las muestras de campo; Katja Luxem y Linta Reji por su ayuda con el trabajo de campo, Anne Kraepiel, F. Morel, JP Bellenger y todos los miembros del laboratorio de Zhang por las discusiones.

Estos autores contribuyeron por igual: Shannon J. Haynes y Romain Darnajoux.

Departamento de Geociencias, Universidad de Princeton, Guyot Hall, Princeton, NJ, 08544, EE. UU.

Shannon J. Haynes, Romain Darnajoux, Eunah Han, Sergey Oleynik y Xinning Zhang

Instituto Ambiental High Meadow, Universidad de Princeton, Guyot Hall, Princeton, NJ, 08544, EE. UU.

Ezra Zimble y Xinning Zhang

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SJH, RD y XZ escribieron el texto del manuscrito. SJH y RD prepararon las figuras. SO construyó el instrumento EPCon utilizado en este estudio. SH lideró el desarrollo metodológico con contribuciones de RD, SO y XZ, SJH, RD, EH y EZ recolectaron muestras de campo y contribuyeron a la adquisición de datos. SJH, RD y EH realizaron análisis de datos. XZ proporcionó experiencia técnica, orientación del proyecto y apoyo financiero. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Shannon J. Haynes o Xinning Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Haynes, SJ, Darnajoux, R., Han, E. et al. Cuantificación de la fijación biológica de nitrógeno por nitrogenasas complementarias independientes de Mo en muestras ambientales con baja actividad de fijación de nitrógeno. Sci Rep 12, 22011 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24860-9

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Recibido: 22 agosto 2022

Aceptado: 22 de noviembre de 2022

Publicado: 20 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24860-9

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