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Dec 01, 2023

Un conjunto de herramientas optogenéticas para la luz.

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1034 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Los antibióticos son un mecanismo de control clave para la biología sintética y la microbiología. Los genes de resistencia se utilizan para seleccionar las células deseadas y regular las poblaciones bacterianas; sin embargo, su uso hasta la fecha ha sido en gran medida estático. El control espaciotemporal preciso de la resistencia a los antibióticos podría permitir una amplia variedad de aplicaciones que requieren un control dinámico de la susceptibilidad y la supervivencia. Aquí, usamos la recombinasa Cre inducible por la luz para activar la expresión de genes de resistencia a los medicamentos en Escherichia coli. Demostramos resistencia activada por la luz a cuatro antibióticos: carbenicilina, kanamicina, cloranfenicol y tetraciclina. Las células expuestas a la luz azul sobreviven en presencia de concentraciones letales de antibióticos, mientras que las que se mantienen en la oscuridad no. Para optimizar la inducción de resistencia, variamos el promotor, el sitio de unión al ribosoma y la fuerza de la variante enzimática utilizando construcciones basadas en cromosomas y plásmidos. Luego vinculamos la resistencia inducible a la expresión de una enzima heteróloga de ácidos grasos para aumentar la producción de ácido octanoico. Estas herramientas de resistencia optogenética allanan el camino para el control espaciotemporal de la supervivencia celular.

Los genes de resistencia a los antibióticos se utilizan ampliamente en biología sintética. Se incluyen en construcciones genéticas para asegurar la propagación del plásmido. Los genes de resistencia también juegan un papel importante en los métodos de clonación. Los ejemplos incluyen inserciones cromosómicas, donde la expresión de genes de resistencia se puede usar como un marcador selectivo para una integración exitosa1, o en la creación de bibliotecas de transposones, donde la resistencia a los medicamentos se usa como un mecanismo de selección intermedio antes de cambiarse por una secuencia alternativa2,3.

Aunque los genes de resistencia a los antibióticos son un elemento básico de la investigación en biología sintética y biotecnología microbiana, existen pocos métodos para el control dinámico de su expresión. La capacidad de controlar la resistencia a los medicamentos espacial y temporalmente podría abrir nuevas vías para la investigación en biología sintética. Como analogía, cuando Sheth et al.4 desarrollaron un origen de replicación inducible, otra característica omnipresente dentro de las construcciones de biología sintética, generó nuevas áreas de investigación, incluido el almacenamiento de datos biológicos5 y el diagnóstico de riboswitch de células enteras6. El control espaciotemporal sobre la resistencia a los medicamentos podría permitir la creación de patrones espaciales en biomateriales vivos7, la selección de células individuales de sistemas microfluídicos8,9 y una mejor comprensión del papel que desempeña la dinámica en la resistencia clínica a los antibióticos10. Por ejemplo, la resistencia a menudo se propaga a través de eventos de transferencia horizontal de genes11,12, que son difíciles de monitorear y controlar a nivel de una sola célula. Los nuevos sistemas de control ofrecen el potencial para futuros estudios que cuantifiquen cómo los diferentes arreglos espaciotemporales de las células que adquieren resistencia pueden conducir a la proliferación o al colapso a nivel de población.

Los métodos optogenéticos son una herramienta poderosa y ampliamente utilizada para controlar la expresión génica13. La entrega de luz a las células se puede regular en el espacio y el tiempo, y se puede integrar directamente en los flujos de trabajo computacionales14,15. Los sistemas optogenéticos en bacterias se han utilizado para controlar la expresión génica para una variedad de aplicaciones13,16, incluso para impulsar el flujo metabólico17, regular el microbioma intestinal18, controlar la morfología celular19 y regular la dinámica de cocultivo20. El uso de la luz para controlar la supervivencia celular ha sido un foco de la ingeniería microbiana en todas las especies. Por ejemplo, la regulación optogenética se ha utilizado para controlar la resistencia a la nourseotricina en Saccharomyces cerevisiae21 y la resistencia a la bleomicina en Yarrowia lipolytica22. En Escherichia coli, la luz se ha utilizado para controlar la resistencia a los antibióticos a través de antibióticos enjaulados en fotografías diseñados individualmente23 o aprovechando la fotosensibilidad natural de la tetraciclina24. Sin embargo, debido a que estos métodos requieren una cuidadosa ingeniería de proteínas o explotan propiedades específicas de un solo fármaco, no se generalizan fácilmente a través de diferentes mecanismos de resistencia. Un enfoque alternativo utilizó un promotor inducible por la luz para controlar de forma reversible la resistencia al cloranfenicol20,25. Tal método podría generalizarse a otros genes de resistencia, sin embargo, los experimentos se limitaron al control de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa. La plataforma ideal para la resistencia inducible por la luz sería tanto generalizable para diferentes genes de resistencia a los antibióticos como ajustable a través de concentraciones de antibióticos para permitir de manera flexible diversos estudios en biología sintética y microbiología.

Para abordar estas necesidades, utilizamos la recombinasa Cre inducible por luz azul OptoCreVvd2 para activar los genes de resistencia a los antibióticos26. Usando este sistema, extirpamos un terminador de transcripción flanqueado por loxP entre un gen y un promotor, lo que permite una mayor expresión génica después de la exposición a la luz azul de 465 nm (Fig. 1a). La tecnología de recombinasa se ha utilizado con éxito para una variedad de aplicaciones que requieren un control sólido e inducible de la expresión génica, incluidos los circuitos lógicos de genes y el seguimiento del linaje celular27,28,29. Seleccionamos este sistema por su tiempo de activación relativamente corto, flexibilidad en el diseño de la construcción (que requiere solo la adición de sitios loxP) y expresión basal mínima en células no inducidas26. Además, el interruptor permanente de APAGADO-ENCENDIDO causado por Cre permite la selección de celdas resistentes en cualquier punto después de la exposición a la luz, lo que permite la memoria celular después de que se haya eliminado la entrada de luz. Si bien esta irreversibilidad no permite dinámicas temporales complejas, la inducción única brinda beneficios que pueden ser ventajosos en ciertas aplicaciones, como permitir la activación irreversible antes de que un cultivo se vuelva demasiado denso para la penetración de la luz o minimizar la exposición en cepas sensibles a la luz.

Los fragmentos de recombinasa Split Cre están vinculados a dominios de fotodímero Vvd inducibles por luz azul. Cuando se expone a la luz azul, Cre se activa y puede eliminar un terminador de transcripción entre dos dominios loxP, lo que permite una mayor expresión de beta-lactamasa (bla). La expresión de OptoCre-bla permite que las células sobrevivan en presencia del antibiótico carbenicilina. b Curvas de concentración inhibitoria mínima (MIC) de construcciones OptoCre-bla integradas cromosómicamente cultivadas en carbenicilina durante 18 h. Las muestras inducidas por la luz se expusieron a la luz azul durante 2 h inmediatamente antes de la exposición a la carbenicilina. Crecimiento medido por OD600 (n = 3). Las cepas, tanto en condiciones de oscuridad como de luz, contienen la construcción de inducción de resistencia y OptoCreVvd2. Las células de control (-) contienen la construcción de activación de la resistencia pero no la recombinasa Cre. Las células de control (+) contienen un gen bla expresado constitutivamente. Las células de tipo salvaje (WT) son MG1655 sin modificación ni plásmidos. c Crecimiento a lo largo del tiempo de construcciones de activación de resistencia OptoCre-bla a través de diferentes concentraciones de carbenicilina. d Recuentos de unidades formadoras de colonias (UFC) de cultivos a partir de datos de CIM (n = 6). Después del crecimiento en carbenicilina durante 18 h, las muestras se colocaron en placas de agar y las colonias se contaron al día siguiente. e Condiciones óptimas de activación de OptoCre-bla. Las construcciones de activación de resistencia crecen en 300 µg/mL de carbenicilina después de la exposición a la luz azul durante 2 h, pero no cuando se mantienen en la oscuridad. El crecimiento se cuantifica por OD600 después de 18 h. Las barras de error muestran la desviación estándar alrededor de la media (n = 3 réplicas biológicas).

Aquí, usamos Cre para inducir la expresión de cuatro genes de resistencia a antibióticos, que seleccionamos por su ubicuidad en aplicaciones de biología sintética, así como por su rango de mecanismos de acción (Tabla 1). Específicamente, elegimos el gen de resistencia a la carbenicilina/ampicilina beta-lactamasa (bla), que es clínicamente relevante y ampliamente utilizado en biología sintética. Los antibióticos betalactámicos inhiben la biosíntesis de la pared celular y son degradados enzimáticamente por la enzima betalactamasa12,30,31. También incluimos la nucleotidiltransferasa de kanamicina (knt), que proporciona resistencia enzimática contra la kanamicina, un antibiótico que causa errores de traducción por parte de la subunidad ribosomal 30S32. La cloranfenicol acetiltransferasa (cat) proporciona resistencia enzimática contra el cloranfenicol, que interfiere con la subunidad ribosómica 50S y hace que se detenga la síntesis de proteínas33. Por último, incluimos la bomba de eflujo de tetraciclina A (tetA) como un mecanismo de resistencia no enzimático basado en el eflujo34. La tetraciclina se une a la subunidad ribosomal 30S para inhibir la síntesis de proteínas35. Estos cuatro antibióticos incluyen tanto fármacos bactericidas (carbenicilina/ampicilina y kanamicina) como bacteriostáticos (cloranfenicol y tetraciclina). Esta selección de mecanismos de resistencia muestra la amplia variedad de mecanismos que se pueden controlar con este sistema e introduce múltiples opciones para herramientas sintéticas que se pueden incorporar a los sistemas bacterianos existentes.

Al controlar la expresión de los genes de resistencia a los antibióticos, las métricas de rendimiento clave incluyen los niveles de expresión inducida y no inducida. Por ejemplo, cuando se usan enzimas potentes como las betalactamasas, incluso una pequeña cantidad de expresión basal puede permitir el crecimiento bacteriano en presencia de un antibiótico. Además, la expresión en el estado inducido también debería ser suficiente para proporcionar resistencia a concentraciones de fármaco comparables a los rangos de trabajo típicos del antibiótico, que podrían variar aún más entre los casos de uso. Para optimizar estas dos funciones en nuestra plataforma, variamos el número de copias del gen, el promotor, el sitio de unión al ribosoma (RBS) y la secuencia de codificación para ajustar la concentración inhibitoria mínima (MIC) del antibiótico en el que las células sobreviven después de la exposición a la luz azul, mientras que mantener niveles de expresión basal que sean lo suficientemente bajos para evitar la activación errónea de la supervivencia. Además, demostramos la activación en vivo de genes de resistencia y caracterizamos las respuestas celulares mediante microscopía de lapso de tiempo de una sola célula.

Finalmente, demostramos la utilidad de la resistencia inducible por la luz en una aplicación biotecnológica al coexpresar genes de resistencia con la tioesterasa heteróloga CpFatB1 para aumentar la producción de ácido octanoico, un ácido graso de cadena media. Los ácidos grasos de cadena media son bioquímicos de alto valor que se utilizan en combustibles, producción de polímeros, saborizantes y fragancias, lo que los convierte en objetivos clave de la ingeniería metabólica36,37. Sin embargo, la inducción de CpFatB1 es metabólicamente exigente, un problema común con la expresión de enzimas heterólogas para aplicaciones de bioproducción. Este desafío ha llevado a los investigadores a desarrollar sistemas en los que el tiempo de expresión de la vía se pueda ajustar con precisión para equilibrar el equilibrio entre el crecimiento y la producción38,39. Por ejemplo, la inducción de luz se ha utilizado para aumentar la producción de otras sustancias químicas en E. coli, como el mevalonato y el isobutanol40. En nuestro sistema con OptoCreVvd2, la inducción de luz de CpFatB1 junto con la selección de antibióticos para una alta expresión de la enzima heteróloga aumentó significativamente la producción de ácidos grasos en comparación con la inducción de luz de CpFatB1 sola.

Este conjunto de herramientas de genes de resistencia inducibles por luz respalda y amplía el uso prolongado de antibióticos como mecanismos de control celular en biología sintética, agregando un mecanismo de control espacial y temporal a los sistemas existentes y sentando las bases para futuras aplicaciones donde la luz se usa en combinación con antibióticos para permitir control flexible del comportamiento celular y la supervivencia.

Para el control optogenético de los genes de resistencia, utilizamos la recombinasa Cre dividida inducible por luz azul OptoCreVvd226. Este sistema permite la escisión de elementos genéticos colocados entre los sitios loxP cuando las células se exponen a la luz azul. La escisión se puede completar en ~ 2 h, lo que es comparable o más rápido que muchos sistemas optogenéticos bacterianos existentes19,25,41,42. Usamos OptoCreVvd2 para extirpar un terminador de transcripción colocado dentro de los sitios loxP entre un promotor y un gen de resistencia a antibióticos, lo que permite la expresión del gen de resistencia solo después de la exposición a la luz azul.

Primero usamos este sistema para controlar la transcripción del gen de resistencia a la betalactamasa (bla) (que denominamos 'OptoCre-bla', Fig. 1a). Los antibióticos betalactámicos, incluidas la ampicilina y la carbenicilina, inhiben la biosíntesis de la capa de peptidoglucano en la pared celular bacteriana. Las enzimas beta-lactamasa pueden inactivar los antibióticos betalactámicos hidrolizando el anillo betalactámico del antibiótico43. Para estos estudios, utilizamos la betalactamasa TEM-116, que se usa comúnmente en casetes de resistencia a antibióticos para la selección de plásmidos44. Integramos esta construcción genética después de nupG en el cromosoma E. coli MG1655.

Para medir la resistencia a los antibióticos inducida por la luz, expusimos cultivos de OptoCre-bla a luz azul durante 2 h, luego los cultivamos durante la noche en presencia de carbenicilina y comparamos el crecimiento con cultivos mantenidos en la oscuridad. Observamos diferencias dependientes de la luz azul en la proliferación celular, donde la CIM necesaria para prevenir el crecimiento fue de 300 µg/mL para cultivos mantenidos en la oscuridad y de 1200 µg/mL para cultivos expuestos a luz azul (Fig. 1b). Las células de control negativo (-control) con solo el indicador y sin recombinasa Cre tuvieron una supervivencia comparable a las células con la construcción completa cultivada en la oscuridad, lo que indica una baja expresión de bla en el estado no inducido. Las células de control positivo (+ Control) con expresión constitutiva de bla de su promotor nativo y RBS crecieron en todas las concentraciones de carbenicilina probadas, incluso a niveles por encima de la cepa inducible por luz, como se esperaba para una cepa completamente resistente que expresa el gen de resistencia en su forma nativa. contexto. Además, incluimos E. coli MG1655 como un control negativo de tipo salvaje, que no creció en ninguna concentración de carbenicilina utilizada aquí.

Para confirmar que las células inducidas por la luz azul crecen a tasas comparables a las de la cepa de control positivo, recopilamos datos de series temporales que demuestran tasas de crecimiento normales en una amplia gama de concentraciones de carbenicilina para células cultivadas con luz azul, mientras que las células sin inducción de luz no lograron crecer. (Figura 1c). Validamos aún más los datos de MIC basados ​​en la densidad óptica mediante el uso de recuentos de unidades formadoras de colonias (UFC) después de la exposición a antibióticos (Fig. 1d). Aunque los datos de MIC son una evaluación precisa del crecimiento celular en presencia de antibióticos, los antibióticos betalactámicos también provocan la filamentación celular, lo que puede aumentar las lecturas de densidad óptica (OD) incluso cuando las células no se están dividiendo, lo que hace que la resistencia bla sea específicamente importante para confirmar mediante CFU medición45. Sin embargo, nuestros resultados utilizando recuentos de UFC confirman que las mediciones de densidad óptica también se traducen en una clara diferencia en la supervivencia celular46. En general, encontramos que OptoCreVvd2 se puede usar para inducir la resistencia a la betalactamasa e identificamos concentraciones de carbenicilina con diferencias sólidas entre la expresión activada por luz azul y oscura de la construcción del gen de resistencia bla (Fig. 1e y Tabla 2).

A continuación, buscamos generalizar este sistema a otros genes de resistencia a los antibióticos. Si bien la escisión de un terminador puede acoplar fácilmente la luz a la expresión de un gen de resistencia a los antibióticos, esto no es lo mismo que la supervivencia inducible por la luz. El control de la supervivencia requiere una expresión baja o nula del gen de resistencia a los antibióticos en la oscuridad, de modo que las células sigan siendo susceptibles a los antibióticos. El diseño también requiere que la inducción del gen de resistencia sea suficiente para conferir resistencia. Los umbrales para estas dos características pueden variar drásticamente con diferentes mecanismos de resistencia a los antibióticos, que tienen diferentes tasas de degradación y exportación de antibióticos. Por lo tanto, mientras que el trabajo previo en nuestro laboratorio ha demostrado que OptoCreVvd2 puede controlar la expresión de una proteína fluorescente con una expresión basal baja y un cambio de 10 veces con la luz26, es posible que reemplazar ingenuamente el gen de fluorescencia con un gen de resistencia a los antibióticos no produzca el comportamiento deseado. Por lo tanto, definimos un proceso general para adaptar el sistema OptoCreVvd2 a diferentes genes de resistencia a los antibióticos (bla, knt, cat y tetA) y pudimos mostrar la supervivencia en rangos personalizados de concentración de antibióticos.

Para generalizar nuestro sistema a otros antibióticos, comenzamos intercambiando bla por kanamicina nucleotidiltransferasa (knt) en nuestra construcción de inducción para hacer OptoCre-knt (Fig. 2a). El antibiótico kanamicina provoca errores de traducción al unirse a la subunidad 30S del ribosoma bacteriano. La enzima knt cataliza la transferencia de un nucleótido a la kanamicina, inactivando el antibiótico32. Aunque nuestro diseño inicial de OptoCre-knt mostró activación de la resistencia usando luz, la concentración de kanamicina requerida para ver esta diferencia fue muy alta: más de 1000 µg/mL (Fig. 2b), en comparación con 25–50 μg/mL comúnmente utilizados para el plásmido. propagación24,44. Aunque no es esencial hacer coincidir las concentraciones de trabajo comunes de los antibióticos, el uso de concentraciones cercanas a estos rangos brinda beneficios, incluida la capacidad de estudiar los efectos en la comunidad a concentraciones fisiológicas y la limitación de las necesidades generales de antibióticos.

a Los niveles de expresión del gen knt de resistencia a la kanamicina se pueden ajustar cambiando la fuerza del promotor y RBS, así como el origen de la replicación. La fuerza del promotor varía de P (media) a P* (media-baja) a P** (baja). La fuerza de RBS varía de R (fuerte) a R* (débil). b Curvas MIC de casetes de activación OptoCre-knt en el cromosoma, con promotor P, P* o P** y RBS R o R* (n = 3). c Curvas MIC de casetes de activación OptoCre-knt en un plásmido con el origen de replicación p15A (n = 3). d Condiciones óptimas de activación de OptoCre-knt, usando P* y R en el cromosoma a 300 µg/mL de kanamicina. El crecimiento se cuantifica por OD600 después de 18 h. Las barras de error muestran la desviación estándar alrededor de la media (n = 3 réplicas biológicas).

Por lo tanto, nos propusimos ajustar la expresión génica mediante la optimización de la arquitectura genética que rodea al gen. Para reducir la expresión basal, debilitamos el promotor o RBS que impulsa la expresión de knt. Al cambiar el promotor y RBS de OptoCre-knt, pudimos cambiar la expresión del gen de resistencia para permitir la supervivencia a concentraciones de antibiótico mucho más cercanas a la MIC de MG1655 de tipo salvaje (Fig. 2b). Probamos una variedad de combinaciones de promotores y RBS para mostrar cómo estas alteraciones afectan la supervivencia a concentraciones variables de antibióticos. Utilizamos promotores constitutivos de fuerza variable, todos basados ​​en el promotor viral T7A1, que van desde fuerza transcripcional media, P, a media-baja, P*, a baja, P**. También usamos el RBS del gen 10 en el fago T747, que denotamos R, y un RBS que diseñamos computacionalmente para que sea más débil48, que denotamos R* (Fig. 2a). El cambio de P a P* redujo la MIC para el estado oscuro a 200 µg/mL de kanamicina, mientras que P** la redujo aún más a 150 µg/mL (Fig. 2b). La MIC para el estado ligero también se redujo, como se esperaba, pero aún mantuvo una amplia gama de concentraciones de kanamicina que dieron como resultado la supervivencia. Con P*, los niveles de kanamicina entre 200 y 800 µg/mL dieron como resultado una supervivencia inducida por la luz, mientras que para P** el rango fue de 150 a 500 µg/mL. El uso de R* en combinación con P provocó una disminución drástica tanto en la CIM del estado oscuro como en las concentraciones efectivas para la supervivencia inducida por la luz, lo que resultó en un rango estrecho entre 4 y 6 µg/mL de kanamicina.

Aunque las construcciones integradas cromosómicamente utilizadas hasta ahora tienen las ventajas de una baja expresión de fondo y no requieren un marcador de selección, los plásmidos ofrecen sus propias ventajas para los sistemas de resistencia inducibles por luz. Muchos genes de resistencia se encuentran naturalmente en plásmidos, y un origen de plásmido permite la transferencia conveniente de sistemas entre diferentes cepas. Además, caracterizamos nuestras construcciones en plásmidos que contienen el origen de replicación p15A, que tiene aproximadamente diez copias por célula (Fig. 2c)49. El cambio de la integración cromosómica a un plásmido p15A aumentó el rango de concentraciones de antibiótico en el que las células que contienen OptoCre-knt sobreviven selectivamente en más de 5 veces. A pesar de este aumento, encontramos que estrategias como la reducción del promotor o la fuerza de RBS pueden tener un efecto de contrapeso. También caracterizamos un OptoCre-bla basado en plásmido p15A, sin embargo, su resistencia basal era demasiado alta para ser considerada funcional (Fig. 1a complementaria). En general, el sistema basado en plásmidos con OptoCre-knt elimina la necesidad del proceso de inserción cromosómica, lo que aumenta la facilidad con la que estas construcciones pueden usarse en diferentes cepas o contextos.

La flexibilidad que brindan estos diferentes diseños nos llevó a desarrollar múltiples construcciones, y es probable que la construcción óptima sea específica de la aplicación. Por ejemplo, las concentraciones más bajas que se muestran aquí están cerca de la CIM de tipo salvaje, lo cual es óptimo para los estudios que buscan caracterizar la adquisición de resistencia usando concentraciones de antibiótico fenotípicamente relevantes. Por el contrario, las concentraciones más altas permiten una selección de células más estricta para estudios en los que solo deberían sobrevivir las células activadas. A través de este proceso de optimización, encontramos construcciones que permiten un mayor cambio de MIC de kanamicina entre cultivos oscuros y expuestos a la luz en comparación con nuestra construcción original, en particular, P* y R que impulsan la expresión de OptoCre-knt en el cromosoma es un ejemplo ideal de nuestro diseño optimizado. (Fig. 2d y Tabla 2).

La supervivencia inducida por la luz requiere un estado APAGADO estricto en el que las células son susceptibles a los antibióticos. Como hemos demostrado, esto se puede lograr con una baja expresión basal del gen de resistencia. Sin embargo, el estado no inducido también se puede minimizar si la propia enzima de resistencia es más débil. Por lo tanto, cuando activamos la enzima cloranfenicol acetiltransferasa (cat), aprovechamos una mutación conocida para disminuir la fuerza de la propia enzima. El cloranfenicol previene la síntesis de proteínas al unirse a la subunidad ribosomal 50S, donde inhibe la formación de enlaces peptídicos. La enzima cat evita que el cloranfenicol se una al ribosoma al unir un grupo acetilo del acetil-CoA al antibiótico50. Mediante el uso de la variante catT172A más débil51,52, disminuimos la concentración de antibiótico a la que sobreviven las células (Fig. 3a). En el diseño OptoCre-cat, usamos el promotor P y RBS R, y comparamos la supervivencia inducida por la luz de cat y catT172A. Aquí observamos una disminución más pronunciada en la resistencia al estado apagado oscuro con catT172A en comparación con cat, lo que reduce la resistencia basal a la de la cepa de tipo salvaje en una construcción integrada cromosómicamente (Fig. 3b). También observamos una disminución en los valores de MIC para cat y catT172A en un origen de plásmido p15A (Fig. 3c). Este enfoque de optimización de enzimas mutantes puede ser particularmente útil cuando se trabaja con enzimas que muestran resistencia a altas concentraciones de antibiótico, incluso con una expresión génica basal mínima, o si se utiliza este sistema en un plásmido con un alto número de copias donde es difícil limitar la expresión basal. . Este enfoque crea otro punto en el que se pueden ajustar los niveles de resistencia, y la diferencia de crecimiento inducida por la luz que muestra catT172A en un origen de plásmido p15A es un diseño optimizado particularmente versátil (Fig. 3d y Tabla 2).

a La resistencia proporcionada por el gen cat de resistencia al cloranfenicol se puede reducir utilizando la variante catT172A en un origen cromosómico o plásmido. b Curvas MIC del casete de activación OptoCre-cat con la enzima nativa cat o la enzima debilitada catT172A en el cromosoma (n = 3). c Curvas MIC de los casetes de activación cat y catT172A en un plásmido con origen p15A (n = 3). d Condiciones de activación óptimas, utilizando catT172A con el promotor P y RBS R en un origen de plásmido a 75 µg/mL de cloranfenicol. El crecimiento se cuantifica por OD600 después de 18 h. Las barras de error muestran la desviación estándar alrededor de la media (n = 3 réplicas biológicas).

Nos preguntamos si sería posible ajustar los niveles de resistencia ajustando las propiedades de exposición a la luz. Para probar esto, caracterizamos aún más el diseño OptoCre-cat modificando la duración y la intensidad de la exposición a la luz (Fig. 2 complementaria). Descubrimos que los niveles de resistencia eran ajustables y dependían de una combinación de la duración de la exposición a la luz y la intensidad de la luz azul.

Un problema común con muchos de nuestros diseños es que la expresión basal da como resultado niveles de resistencia que, aunque bajos, aún superan los observados en la cepa de tipo salvaje. En principio, esta fuga podría ser el resultado de varios problemas diferentes, incluidos eventos de recombinación espontánea, mutaciones en el terminador o lectura completa del terminador. Secuenciamos la región loxP y el terminador de la cepa de control (-) sin Cre tanto en condiciones de cloranfenicol de 0 µg/mL como de cloranfenicol de 75 µg/mL, donde esta última representa la condición de concentración de antibiótico más alta que mostró cualquier crecimiento. Los resultados de la secuenciación de ambas condiciones coincidieron con la secuencia original del plásmido, lo que confirma que la expresión con fugas no es el resultado de una recombinación espontánea o mutaciones terminadoras. Estos resultados están en línea con las caracterizaciones del diseño original de OptoCreVvd2, que mostró una expresión basal baja consistente de un fluoróforo sin evidencia de recombinación espontánea26. Para mitigar el potencial de lectura completa del terminador, intentamos reducir la expresión basal al cambiar el terminador fuerte BBa_B0015 de nuestro diseño original por el terminador sintético L3S2P21, que fue el terminador más fuerte identificado en un conjunto extenso caracterizado en Chen et al.53. Sin embargo, esto no mostró una mejora adicional con respecto al terminador utilizado en nuestro diseño inicial (Fig. 3 complementaria), por lo que no continuamos con esta vía. Para aplicaciones donde la expresión basal mínima es crítica, los diseños alternativos podrían probar otros terminadores53,54 o diferentes enfoques de diseño de circuitos55,56,57.

La inducción de luz también se puede aplicar a mecanismos de resistencia a antibióticos no enzimáticos, como la bomba de eflujo tetA. El antibiótico tetraciclina se une reversiblemente a la subunidad ribosomal 30S, inhibiendo la síntesis de proteínas. La bomba de eflujo tetA se localiza en la membrana interna y exporta complejos de quelato de magnesio-tetraciclina mediante la importación de un protón35. En marcado contraste con bla, knt y cat, donde los niveles de resistencia nativos eran altos y nuestros esfuerzos de ingeniería tenían como objetivo reducir la potencia, encontramos que nuestro diseño inicial para tetA inducible no mostró resistencia sobre MG1655 de tipo salvaje cuando se expresó con el promotor P y RBS R en un plásmido de origen p15A (Fig. 1b complementaria), condiciones que produjeron los niveles más altos de resistencia en las construcciones que probamos anteriormente. Para compensar esto, optamos por usar el fuerte promotor nativo Ptet con su correspondiente RBS Rtet para permitir la expresión completa del gen tetA58 para crear OptoCre-tetA (Fig. 4a). Usando esta arquitectura nativa, OptoCre-tetA mostró cierta activación cuando se integró cromosómicamente (Fig. 4b) y exhibió una fuerte activación en el origen del plásmido p15A (Fig. 4c). En particular, la resistencia basal en estado oscuro sobre MG1655 de tipo salvaje fue mínima, lo que permitió la activación de OptoCre-tetA a concentraciones bajas de tetraciclina. Por lo tanto, encontramos que la versión basada en el plásmido p15A es una construcción ideal para la resistencia a la tetraciclina (Fig. 4d y Tabla 2).

un gen de resistencia a la tetraciclina tetA se expresa utilizando el promotor nativo Ptet y RBS Rtet nativo, para permitir la expresión máxima del gen. b Curvas MIC de OptoCre-tetA en el cromosoma y c Origen del plásmido p15A (n = 3). d Condiciones óptimas de activación de OptoCre-tetA, utilizando el origen del plásmido p15A a 4 µg/mL de tetraciclina. El crecimiento se cuantifica por OD600 después de 18 h. Las barras de error muestran la desviación estándar alrededor de la media (n = 3 réplicas biológicas).

La precisión espacial y temporal habilitada por la optogenética permite que estas construcciones se utilicen para una variedad de aplicaciones, incluidos los estudios unicelulares de resistencia bacteriana a los antibióticos. La forma en que la adquisición de resistencia conduce a la supervivencia bacteriana a nivel de una sola célula es de particular interés en el contexto de la transferencia horizontal de genes. Los estudios existentes de transferencia de genes horizontales de una sola célula han caracterizado previamente las tasas de transferencia de genes y han mostrado conexiones importantes con la detección de quórum59,60. Sin embargo, los casos naturales de transferencia horizontal de genes son poco frecuentes y difíciles de controlar en el espacio y el tiempo, especialmente en relación con la exposición a antibióticos. Estudios previos también han demostrado que la adquisición estocástica de resistencia en células individuales no siempre es suficiente para provocar la proliferación de células fenotípicamente resistentes61. Para estudiar cuándo los eventos de transferencia horizontal de genes conducen a la propagación de la resistencia en las poblaciones, sería interesante modelar la adquisición de resistencia de una sola célula con control optogenético de la susceptibilidad a los antibióticos. Esto podría usarse para caracterizar cuándo y cómo la adquisición de resistencia en células individuales conduce a la evasión de antibióticos, y cómo los programas y concentraciones de dosificación de antibióticos específicos afectan la frecuencia de evasión.

Aquí mostramos una prueba de concepto para los primeros pasos en esta clase de estudios al inducir el crecimiento celular usando luz azul para las células en almohadillas de agarosa. Usando microscopía de lapso de tiempo, colocamos células que contenían resistencia a antibióticos activables por luz en almohadillas de agarosa que contenían antibióticos y comparamos el crecimiento de las células que se mantuvieron en la oscuridad con las expuestas a la luz azul. Para estos estudios, elegimos centrarnos en un subconjunto de genes de resistencia, seleccionando kanamicina y cloranfenicol como ejemplos de antibióticos bactericidas y bacteriostáticos, respectivamente. Caracterizamos la activación de resistencia para la resistencia OptoCre-knt integrada cromosómicamente a la kanamicina (Fig. 5a y Película complementaria 1), y la resistencia OptoCre-cat basada en plásmido al cloranfenicol (Fig. 5b y Película complementaria 2). Descubrimos que las células con resistencia inducida por la luz mostraron un breve retraso antes del crecimiento en comparación con sus controles positivos constitutivamente resistentes, lo que probablemente corresponde al tiempo necesario para eliminar el terminador de la transcripción y permitir la expresión del gen de resistencia. Por el contrario, cuando las células se mantuvieron en la oscuridad, se inhibió el crecimiento y observamos ejemplos de pérdida de integridad de la membrana (Película complementaria 1–2). Para cuantificar la recuperación de las células inducidas por la resistencia, calculamos el porcentaje de células en el cuadro inicial que se recuperaron en el transcurso de la película (Figura 4 complementaria). Definimos el tiempo de recuperación como el punto en el que una célula se divide por primera vez, y encontramos una recuperación del 70 % para OptoCre-knt y una recuperación del 42 % para OptoCre-cat con exposición a la luz (en comparación con el 13 % y el 4 % para las células en la oscuridad, aunque, en particular, las células en la oscuridad rara vez experimentaron más de un evento de división, Película complementaria 1-2). Aunque estos datos muestran claras diferencias entre la exposición a la luz y la oscuridad, las tasas incompletas de recuperación bajo la exposición a la luz pueden deberse a la exposición simultánea al antibiótico y la luz, lo que probablemente hace que algunas células no sean viables antes de que puedan ser inducidas. En el futuro, los experimentos de microfluidos podrían ayudar a evaluar las tasas de recuperación en función de la inducción de luz relativa y el tiempo de adición de antibióticos.

Activación de a la construcción de resistencia cromosómica OptoCre-knt con el promotor P* y RBS R en almohadillas de agarosa que contienen 400 µg/mL de kanamicina, yb la construcción de resistencia OptoCre-cat basada en plásmido p15A usando catT172A con el promotor P y RBS R en almohadillas de agarosa que contiene 60 µg/ml de cloranfenicol. Las imágenes de microscopía muestran muestras representativas de las cepas de activación de resistencia en la oscuridad o con luz azul (barra de escala = 2 µm). Los recuentos de células a lo largo del tiempo son acumulativos en múltiples posiciones de imágenes para cada condición, y cada gráfico contiene la cepa resistente a OptoCre junto con controles negativos y positivos (n = 3 réplicas biológicas).

Mirando hacia futuras aplicaciones que requieren el control de subpoblaciones de células, también utilizamos un dispositivo de microespejo digital (DMD)62 para activar la resistencia en un subconjunto de células. El DMD permite la iluminación programada de áreas específicas dentro de un campo de visión. Iluminamos la mitad del campo de visión y vimos la activación preferencial de las células en la región iluminada con luz azul (Fig. 5 complementaria). Observamos cierto crecimiento en un subconjunto de las celdas en la mitad oscura del campo de visión, aunque a niveles reducidos en relación con la mitad iluminada. Esto puede deberse a la difusión de la luz del DMD, ya que no vemos esta activación hasta que comienza la iluminación del DMD. En comparación con las exposiciones más largas y de menor intensidad que usamos en los experimentos de cultivo líquido, el DMD está diseñado para brindar períodos intensos de luz. Estas diferencias sugieren que los protocolos y configuraciones de activación de DMD podrían optimizarse para mejorar el tiempo de activación en el futuro.

Para demostrar la utilidad del sistema para aplicaciones biotecnológicas, a continuación nos enfocamos en aumentar el rendimiento de ácido octanoico a través de la coexpresión de cat o tetA con la tioesterasa CpFatB1 (Fig. 6a-b). CpFatB1 se deriva de la especie vegetal Cuphea palustris y se ha optimizado para su expresión en E. coli63. La expresión de CpFatB1 es exigente para las células, por lo tanto, acoplar directamente su expresión inducida con la resistencia a los antibióticos puede permitir el crecimiento selectivo de las células que producen activamente ambas enzimas, evitando así el crecimiento de las células que no expresan (Fig. 6c). Utilizamos OptoCre-cat con el mutante catT172A y OptoCre-tetA para la selección debido a sus amplios rangos de inducción y resistencias basales mínimas en el esqueleto del plásmido p15A. Para la producción de ácidos grasos, utilizamos la variante altamente activa CpFatB1.2-M4-287 que se ha demostrado anteriormente que aumenta la producción de ácido octanoico63. Para optimizar la expresión del gen CpFatB1 sin interrumpir la arquitectura de activación de la resistencia, lo colocamos inmediatamente aguas abajo del gen de resistencia bajo la expresión de un RBS fuerte diseñado computacionalmente denominado R'. De acuerdo con el protocolo para inducir la resistencia a los antibióticos solo, realizamos la inducción exponiendo las células a la luz azul durante 2 h al principio de la fase de crecimiento. Desde una perspectiva de bioproducción, una ventaja del sistema OptoCreVvd es su irreversibilidad, lo que permite la activación permanente de CpFatB1 sin necesidad de iluminación continua. Esto evita problemas con los sistemas de inducción de luz dinámica, donde la penetración de la luz puede convertirse en una preocupación para cultivos celulares densos en contextos de ingeniería metabólica40,64. Descubrimos que la inducción de luz por sí sola condujo a un aumento significativo en la producción de ácido octanoico para los sistemas cat y tetA. Luego preguntamos si la introducción de la selección de antibióticos podría mejorar aún más los rendimientos. Descubrimos que con OptoCre-cat, agregar 150 µg/mL de cloranfenicol mejoró significativamente la producción, incrementándola en un 29 % con respecto a la condición de inducción de luz solamente, con concentraciones más altas de cloranfenicol que resultaron en un rendimiento similar (Fig. 6d). La inducción de luz sola o con antibiótico también mostró una mejora sustancial en el rendimiento con respecto a una versión expresada constitutivamente de CpFatB1 con arquitectura genética idéntica y expresión constitutiva de recombinasa Cre (Fig. 6d). Con OptoCre-tetA, la producción de ácido octanoico aumentó un 150 % con respecto a la inducción de luz sola cuando se complementó con 1,5 µg/mL de tetraciclina (Fig. 6e). Las concentraciones más altas de tetraciclina mejoraron aún más el rendimiento, alcanzando un aumento del 300 % con respecto a la luz sola cuando se añadieron 6 µg/ml de tetraciclina. Estas concentraciones se encuentran en el rango superior de los niveles de resistencia que vemos en nuestros experimentos MIC para las cepas respectivas, posiblemente debido a la mayor OD (OD600 ≈ 0,6) en el momento en que se agregan los antibióticos en nuestro protocolo de bioproducción. El sistema de inducción con OptoCre-tetA no impulsó la producción sobre la expresión constitutiva de CpFatB1, aunque la adición de antibiótico mejoró en gran medida el rendimiento sobre la luz sola (Fig. 6e). Es importante destacar que las versiones expresadas constitutivamente de las construcciones cat y tetA mostraron perfiles de crecimiento deficientes en comparación con las versiones inducibles por luz (Fig. 6 complementaria). Este déficit de crecimiento en las construcciones constitutivas es problemático, ya que puede dar lugar a mutantes de escape y reducir la estabilidad de las cepas de producción. Por lo tanto, la combinación de la producción de ácido octanoico con la selección de resistencia conduce a mayores rendimientos de ácido octanoico que la inducción de luz sola, sin el déficit de crecimiento impuesto asociado con la producción continua.

a Activación de OptoCre-cat usando catT172A o b OptoCre-tetA se acopla con CpFatB1 introduciendo el gen cadena abajo del marcador de resistencia a fármacos bajo el fuerte RBS R'. c La luz azul induce la expresión del gen de resistencia y CpFatB1, pero no garantiza que todos los individuos dentro de una comunidad expresen los genes. Los no productores tienen una ventaja de crecimiento debido a la carga de CpFatB1. La adición de cloranfenicol evita el crecimiento de cualquier individuo que no produzca el gen de resistencia y, en consecuencia, CpFatB1. d Producción de ácido octanoico junto con OptoCre-cat medida por GC-MS. e Producción de ácido octanoico junto con OptoCre-tetA medida por GC-MS. La significación se determinó mediante una prueba t de Welch de dos colas: *P < 0,05; ns no significativo. Las barras de error muestran la desviación estándar alrededor de la media (n = 3 réplicas biológicas).

Al comparar las construcciones OptoCre-cat y OptoCre-tetA, descubrimos que, si bien OptoCre-cat mostró una mayor producción en general, OptoCre-tetA mostró un mayor aumento en la producción con concentraciones crecientes de antibiótico en el rango probado. Esto podría deberse a la diferencia entre los tipos de resistencia (enzimática frente a eflujo) y su impacto en la dinámica de la población, o los diferentes promotores de las construcciones (P frente a Ptet), lo que sugiere que estas construcciones y su inducción probablemente podrían optimizarse aún más para incrementar la producción. Este trabajo muestra el potencial del uso de la luz para controlar la resistencia a los antibióticos en aplicaciones de bioproducción e ingeniería metabólica.

Hemos desarrollado y optimizado sistemas controlados optogenéticamente para cuatro genes de resistencia a antibióticos. Usando una recombinasa Cre inducible por luz azul, hemos demostrado la activación de bla, knt, cat y tetA para inducir resistencia en un rango de concentraciones de antibióticos. Estos genes de resistencia abarcan múltiples mecanismos y representan antibióticos y genes de resistencia comúnmente utilizados en laboratorios de biología sintética y microbiología. Un aspecto crucial del diseño de resistencia inducible es el nivel de expresión en los estados inducido y no inducido, y los niveles óptimos varían dramáticamente con la fuerza del gen de resistencia. Por lo tanto, probamos promotores, RBS y enzimas mutantes de fuerza variable para encontrar construcciones que muestren una expresión basal óptima y cambios de activación de resistencia. Para controlar el número de copias a nivel de ADN, también comparamos construcciones cromosómicamente integradas en la región nupG y en un plásmido de copia medio p15A, lo que mejoró la flexibilidad en el diseño experimental. Descubrimos que la optimización de construcciones de inducción de resistencia en los niveles de promotor, RBS, enzima y número de copias se puede utilizar como un enfoque generalizable, proporcionando múltiples opciones para alterar la expresión para permitir flexibilidad en el diseño de construcción para cumplir con las restricciones experimentales. Por ejemplo, los estudios que requieren un promotor nativo, un origen de plásmido específico o una proteína de resistencia particular para que sean compatibles con otros elementos del diseño de la cepa pueden adaptarse a medida que este sistema se adapta a diferentes casos de uso u otros genes de resistencia. Este sistema también permite la expansión de genes de resistencia más allá de los que se muestran aquí, utilizando los enfoques de optimización mencionados anteriormente. Los experimentos futuros que caractericen la expresión directamente también podrían ser una ruta eficaz para optimizar aún más los diseños. El uso de técnicas como qPCR o Western blot podría permitir la medición relativa de los niveles de transcripción y traducción, o las fusiones de proteínas con un fluoróforo podrían permitir la medición en los casos en que se sabe que la fusión no afecta la función.

Seleccionamos los cuatro mecanismos de resistencia a los antibióticos aquí para ser ampliamente aplicables tanto para usos de biología sintética como de microbiología. Estos antibióticos y genes de resistencia se utilizan a menudo como marcadores de selección de plásmidos y en sistemas de control de biología sintética24,44. Como ejemplo de una aplicación, estas construcciones tienen el potencial de aplicarse a la selección de una sola célula en sistemas de microfluidos. La selección de células individuales de interés de un dispositivo microfluídico es un desafío, y los métodos actuales requieren trampas ópticas complejas y dispositivos microfluídicos basados ​​en válvulas9. La combinación de la resistencia inducible por la luz con un DMD62 para la orientación precisa de la luz permitiría la selección de antibióticos de una línea celular de interés del flujo de salida del dispositivo, sin ninguna modificación del chip ni requisitos de hardware adicionales más allá de la exposición a la luz. El uso de la luz también permite la integración en flujos de trabajo computacionales, lo que podría facilitar el cribado y la selección automatizados de fenotipos de interés. El interruptor permanente garantizaría que la señal de selección no se pierda, lo que permitiría recolectar la progenie de bacterias seleccionadas para su caracterización en cualquier momento después de la activación. Además, dada la prevalencia de las recombinasas en la lógica celular28, este sistema podría integrarse modularmente con circuitos de recombinasa más grandes como una salida lógica que controla la supervivencia celular. Por ejemplo, los genes de resistencia controlados por recombinasa podrían usarse ampliamente para regular la supervivencia celular solo si se cumplen ciertas condiciones ambientales (por ejemplo, molécula pequeña, luz o temperatura)28. En estos casos, puede valer la pena usar una versión constitutiva de OptoCreVvd2, en lugar de la versión inducible por IPTG que se usa aquí, para simplificar el flujo de trabajo y minimizar los requisitos de inducción química. Como tanto las recombinasas como los genes de resistencia seleccionados se usan comúnmente en biología sintética, esto permite que el control optogenético se incorpore directamente a los sistemas genéticos existentes.

Además, prevemos que estos genes de resistencia a los antibióticos inducibles por la luz sean útiles como un sistema sintético para estudiar la transferencia horizontal de genes. Estos sistemas son adecuados para examinar cómo los eventos de adquisición de genes de resistencia de una sola célula conducen a la expansión o disminución de la población. Ser capaz de activar permanentemente la "adquisición" de genes de resistencia usando luz elimina la necesidad de confiar en las observaciones de eventos de transferencia de genes horizontales naturales poco frecuentes y estocásticos. En particular, bla es particularmente problemático en entornos clínicos31 y se sabe que se transfiere ampliamente cuando el intestino se expone a la ampicilina12. Estudios recientes que analizan instancias unicelulares de transferencia horizontal de genes también han demostrado que la detección de quórum y las estructuras de biopelículas pueden ser importantes para iniciar eventos de transferencia59,60; sin embargo, los experimentos hasta ahora se han limitado al estudio de eventos de transferencia horizontal poco frecuentes. De manera crítica, debido a que no todos los eventos de adquisición de resistencia conducen a la proliferación de poblaciones resistentes61, el control sintético de la adquisición de resistencia podría revelar cuándo y cómo proliferan las células que adquieren resistencia. En el futuro, este sistema también podría modificarse para permitir que la resistencia se apague o controle de manera reversible, lo que permitirá tanto la adquisición de la resistencia como los estudios de pérdida. El uso de la luz como inductor también permite realizar estudios con dinámica espacial, más allá de lo que podría lograrse mediante la inducción química. Sin embargo, la penetración de la luz puede convertirse en un problema para geometrías espaciales 3D complejas. En general, el control espacial y temporal que brindan estos sistemas optogenéticos podría permitir a los investigadores determinar qué arreglos celulares y programas de tratamiento con antibióticos conducen a la expansión o el colapso de las comunidades microbianas que consisten en células resistentes y sus vecinos susceptibles61,65.

Este sistema también brinda beneficios novedosos a los sistemas de bioproducción sintética, que demostramos en un estudio piloto usando CpFatB1 para aumentar la producción de ácido octanoico. Aunque son eficientes, la expresión y la actividad enzimática de CpFatB1 son exigentes a niveles elevados, lo que resulta en una ventaja de crecimiento para los no productores y puede generar trampas63,66. Al acoplar la expresión de un gen de resistencia con la enzima de bioproducción, podemos limitar el crecimiento solo a las células que expresan CpFatB1, aumentando aún más el rendimiento sobre el sistema equivalente con inducción de luz sola. Este trabajo puede expandirse a otras enzimas de bioproducción de interés, o coexpresarse con múltiples genes para requerir la expresión de varias enzimas en una vía de crecimiento.

Los genes de resistencia a los antibióticos son herramientas ubicuas y fundamentales de la biología sintética. Sin embargo, existen pocos métodos actuales que permitan una regulación dinámica de su expresión. La capacidad de activar la resistencia mediante la luz amplía esta herramienta central, mejorando el control espaciotemporal y permitiendo nuevas aplicaciones en la selección celular y el estudio de la adquisición de resistencia a los antibióticos.

Todos los ensayos de resistencia a los antibióticos utilizan la cepa MG1655 de E. coli. Construimos plásmidos utilizando el método de ensamblaje Gibson67, o utilizando el ensamblaje Golden Gate68 en los casos en que las construcciones contenían fragmentos de menos de 100 pares de bases de longitud (Tabla complementaria 1).

Las construcciones integradas cromosómicamente se insertaron utilizando el sistema de recombinasa Lambda Red1 corriente abajo de nupG (sitio de homología directa: GGTTCTGGCCTTCGCGTTCATGGCGATGTTCAAATATAAACACGT, inversa: GGCGTGAAACGGTTGTACGGTTATGTGTTGAAGTAAGAATAA). Se usaron casetes de resistencia a antibióticos flanqueados con sitios FRT para seleccionar integraciones exitosas (usamos knt para construcciones de activación de bla y cat, cat para construcciones de activación de knt y tetA); estos casetes luego se curaron utilizando una recombinasa FLP basada en plásmido en un origen sensible a la temperatura siguiendo el protocolo de Datsenko y Wanner1. Finalmente, curamos el plásmido sensible a la temperatura antes de los experimentos posteriores.

Los plásmidos utilizados para la expresión de OptoCreVvd2 se derivaron de Sheets et al.26. Para los estudios de activación de bla, cambiamos el casete de selección de plásmidos de bla a cat, utilizando el gen de los plásmidos BglBrick44 y los cebadores enumerados en la Tabla 1 complementaria. pBbAk-W4-loxTTlox-mRFP1 de Sheets et al.26. Los orígenes de replicación del plásmido y las secuencias para bla, knt y cat se tomaron de la serie de plásmidos BglBrick44. La mutación catT172A fue tomada de Ciechonska et al.51. La secuencia de tetA se obtuvo del plásmido AddGene #74110 (pRGD-TcR) depositado por Hans-Martin Fischer69. La secuencia para CpFatB1.2-M4-287 se obtuvo de Hernández Lozada et al. y sintetizado utilizando Twist Bioscience63. Las cepas de expresión constitutivas de CpFatB1.2-M4-287 se crearon cotransformando los mismos indicadores utilizados para los experimentos de expresión de luz con pBbE5a-Cre, que actúa de forma constitutiva. Todas las construcciones de resistencia basadas en plásmidos contienen el origen p15A. Las construcciones basadas en plásmidos para la activación de knt contienen cat como marcador de selección, y las construcciones para la activación de bla, cat y tetA contienen knt como marcador de selección de plásmidos. Los controles positivos para bla y tetA contienen el gen respectivo con su promotor nativo y RBS en un plásmido con origen p15A. Los controles positivos para knt y cat contienen el gen respectivo con su promotor nativo y RBS en un plásmido con origen p15A para estudios que usan un reportero basado en plásmido, o integrado en la región nupG para estudios que usan reporteros integrados cromosómicamente. Los promotores utilizados fueron variantes de potencia media, media-baja y baja de T7 A170, denominadas P (TTATCAAAAAGAGTA TTGCAT TAAAGTCTAACCTATAG GAATCT TACAGCCATCGAGAGGGACACGGCGAA), P* (TTATCAAAAAGAGTA TTGTCT TAAAGTCTAACCTATAG GATTCT TACAGCCATCGAGAGGGACACGGCGAA) y P** (TTATCA AAAAGAGTA TTGTAA TAAAGTCTAACCTATAG GATTTT TACAGCCATCGAGAGGGACACGGCGAA). Los subrayados indican mutaciones del promotor T7 A1 original. El sitio de unión al ribosoma R es el RBS del gen 10 en el fago T7 (TTTAAGAAGGAGATATACAT)47. R* (ATCACTCTACGGCCAGCTGCAAAC) se diseñó computacionalmente utilizando De Novo DNA versión 2.1 para tener una fuerza de traducción 10 veces más débil (14,8 AU) en comparación con R (148 AU), y R′ (TTTGTTTAATTACTAAGCGGGAGGTTAT) se diseñó para aumentar la fuerza de traducción (100 000 AU)48 ,71. El terminador rrnB BBa_B0015, utilizado en el pBbAk-W4-loxTTlox-mRFP1 original de Sheets et al.26, se utilizó como terminador flanqueado por loxP en todas las construcciones a menos que se indique lo contrario. El terminador sintético fuerte L3S2P2153 fue sintetizado por IDT y clonado en una variante mCherry del plásmido informador fluorescente original. Los cebadores utilizados para cambiar cada uno de estos elementos se incluyen en la Tabla complementaria 1.

Los plásmidos y las cepas de este estudio y sus secuencias están disponibles en AddGene (https://www.addgene.org/Mary_Dunlop/).

Las cepas se cultivaron durante la noche a partir de una sola colonia en medio LB selectivo que contenía 100 μg/mL de carbenicilina, 30 μg/mL de kanamicina o 25 μg/mL de cloranfenicol según fuera necesario para el mantenimiento del plásmido. Los cultivos se actualizaron 1:100 en medios mínimos M9 selectivos (sales M9 complementadas con MgSO4 2 mM, CaCl2 0,1 mM y glucosa al 0,1 %) durante 2 h con IPTG 100 μM para la inducción de la producción de recombinasa dividida OptoCreVvd2. A continuación, los cultivos se expusieron a luz azul o se mantuvieron en la oscuridad durante 2 horas. La exposición a la luz se realizó con un aparato de placa de luz de 24 pocillos (LPA)72 utilizando cultivos de 1 ml con dos LED de longitud de onda de 465 nM por pocillo (ThorLabs LED465E), con una producción total de 120 μW/cm2 por pocillo. Para el experimento de variación de la intensidad de la luz, se utilizó el LPA para suministrar 5, 60 o 120 μW/cm2 durante 0,5, 1 o 2 horas siguiendo el mismo protocolo.

Las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) se midieron según el protocolo descrito en Wiegand et al.73. Los stocks de antibióticos se hicieron disolviendo el antibiótico en agua destilada estéril (carbenicilina, kanamicina, tetraciclina) o etanol al 99% (cloranfenicol), con concentraciones normalizadas para la potencia según los estándares del CLSI74. Se prepararon placas de ensayo para medir la CIM realizando diluciones en serie de antibiótico en 100 μL de medio mínimo M9 en placas de 96 pocillos. Se utilizaron medios bajos en glucosa para reducir la variabilidad del crecimiento mediante la creación de condiciones de crecimiento que limiten el carbono, en lugar de limitar los nutrientes45. Las concentraciones de antibióticos se seleccionaron para incluir valores que abarcaran los niveles de MIC para los cultivos en estado oscuro y claro en cada experimento. Inmediatamente después de la exposición a la luz, los cultivos se normalizaron por dilución a la densidad óptica (DO) más baja de cada experimento. A continuación, los cultivos normalizados se diluyeron 1/25 en placas de 96 pocillos por triplicado y se cultivaron durante la noche durante 18 ha 37 °C. A continuación, se midió la lectura de absorbancia de DO de cada pocillo a 600 nm (OD600) utilizando un lector de placas BioTek Synergy H1. La secuenciación posterior a la muestra para la cepa informadora OptoCre-cat sola se realizó en un cultivo líquido de las condiciones de crecimiento de 0 μg/mL y 75 μg/mL (justo por debajo de la CIM), al final del período de crecimiento de 18 h para las muestras que se muestran en la figura complementaria 2. Las muestras se amplificaron utilizando la polimerasa Phusion mediante cebadores directos (AAGCCATCCAGTTTACTTTG) e inversos (CCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGG) para abarcar la región terminadora.

Las unidades formadoras de colonias (UFC) se midieron siguiendo el protocolo de micromanchas descrito en Sieuwerts et al.75. Después de que las placas MIC crecieran durante la noche durante 18 h, los cultivos se diluyeron en serie 1:10 en sales M9 1x en una placa de 96 pocillos. Las diluciones de 10−1 a 10−6 se colocaron en placas, con 5 μL en placas de agar LB por duplicado para cada pocillo (n = 6 para cada condición). Las placas se cultivaron durante la noche a 37 °C y las colonias se contaron a mano al día siguiente para obtener la dilución más baja con colonias contables para cada muestra. A continuación, se calcularon los recuentos de UFC por ml multiplicando el nivel de dilución por el número medio de colonias contadas por condición, normalizándose para el volumen de 5 μl en placa.

Las cepas se cultivaron durante la noche a partir de una sola colonia en medio LB selectivo. Los cultivos se actualizaron 1:100 en medio mínimo M9 selectivo durante 2 h con IPTG 100 μM para la inducción de OptoCreVvd2. Luego, las muestras se colocaron en almohadillas de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5 % hechas con medio mínimo M9 que contenía IPTG 100 μM y kanamicina 400 μg/mL (activación knt) o cloranfenicol 60 μg/mL (activación cat). Las muestras se cultivaron a 30 °C para evitar que las almohadillas se sequen y se tomaron imágenes cada 15 min (activación knt) o 20 min (activación catT172A) durante 18 h. Para los experimentos de iluminación de fotograma completo, se tomaron imágenes de las células a 100x utilizando un microscopio Nikon Ti-E. La exposición a la luz azul fue proporcionada por un anillo LED (Adafruit NeoPixel 1586), que se fijó sobre la platina del microscopio y se controló con un Arduino con un script Matlab personalizado para una salida total de 330 μW/cm2. Las imágenes fueron segmentadas y analizadas utilizando el software DeLTA 2.076. Las divisiones celulares se anotaron a mano. Para los experimentos con dispositivos de microespejos digitales (DMD) que iluminan la mitad del campo de visión, se tomaron imágenes de las células a 100x usando un microscopio Nikon Ti-2. La exposición a la luz fue proporcionada por un DMD (Mightex Polygon 400) conectado a la ruta de luz de iluminación del chasis Nikon Ti-2. La luz del DMD pasó a través de un filtro de densidad neutra al 10 % (Chroma UVND 1.0) para un total de 1,2 % de potencia, o 160 mW/cm2, durante 4 de 5 min para cada ciclo de imagen. Se utilizó un microcontrolador Arduino Uno para sincronizar la cámara, la fuente de iluminación y el DMD para la adquisición de imágenes77.

Las cepas se cultivaron durante la noche a partir de una sola colonia en medio LB selectivo. Los cultivos se actualizaron 1:50 en medios mínimos M9 selectivos que contenían glucosa al 2 %78 e IPTG 100 μM para cepas con OptoCreVvd2. Los cultivos se hicieron crecer hasta una DO600 ≈ 0,2. Los cultivos inducidos que contenían OptoCreVvd2 se expusieron luego a luz azul durante 2 h. Inmediatamente después de la exposición a la luz, se añadieron 150, 300 o 600 μg/ml de cloranfenicol o 1,5, 3 o 6 μg/ml de tetraciclina a las células inducidas con OptoCreVvd2. Después de 20 h de crecimiento después de la inducción de luz, se tomaron 400 μL de los cultivos y se prepararon para la cuantificación por cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). Las cepas de CpFatB1 expresadas constitutivamente se cultivaron en condiciones idénticas pero no recibieron luz ni antibióticos. La extracción de ácidos grasos y la derivatización en ésteres metílicos de ácidos grasos se completó según lo descrito por Sarria et al.79. Se añadió a la muestra un patrón interno de ácido nonanoico (C9) a una concentración final de 88,8 mg/L y se agitó antes de la extracción. Las muestras se analizaron con un detector Agilent 6890 N/Agilent 5973 MS utilizando una columna DB-5MS. La temperatura de entrada se fijó en 300 °C con un flujo de 4 ml/min. El programa de calentamiento del horno se fijó inicialmente a 70 °C durante 1 min, seguido de una rampa a 290 °C a 30 °C/min y una retención final a 290 °C durante 1 min. El patrón interno nonanoico se utilizó para la cuantificación del título de ácido octanoico.

Los valores de DO600 en las curvas MIC y gráficos de barras se informan como la media de tres muestras ± la desviación estándar. Los valores de recuento de colonias para las mediciones de CFU se informan como la media de seis muestras que consisten en dos diluciones y placas para cada punto de datos de MIC. La producción de ácidos grasos medida mediante GC-MS se informa como la media de tres réplicas biológicas para cada condición ± la desviación estándar. La significancia estadística (valor P) para la producción de ácidos grasos se evaluó usando una prueba t de Welch de dos colas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos necesarios para evaluar las conclusiones están presentes en el manuscrito y/o en los Materiales Complementarios. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El código de análisis de imágenes se basa en el algoritmo DeLTA 2.0 disponible en https://gitlab.com/dunloplab/delta.

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Damos las gracias a Heidi Klumpe por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. Agradecemos a Caroline Blassick por crear el mutante catT172A ya Mark Isalan por indicarnos esta variante. Este trabajo fue apoyado por NIH subvención R01AI102922 y DOE subvención DE-SC0019387. MBS recibió apoyo a través de la subvención de capacitación NIH T32 EB006359.

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Boston, Boston, MA, 02215, EE. UU.

Michael B. Sheets, Nathan Tague y Mary J. Dunlop

Centro de Diseño Biológico, Universidad de Boston, Boston, MA, 02215, EE. UU.

Michael B. Sheets, Nathan Tague y Mary J. Dunlop

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MBS y MJD concibieron y diseñaron los experimentos. MBS realizó experimentos de inducción de resistencia y analizó los datos. MBS y NT realizaron experimentos de producción de ácidos grasos y analizaron los datos. MBS y MJD escribieron el manuscrito con aportes de NT

Correspondencia a Mary J. Dunlop.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Sheets, MB, Tague, N. & Dunlop, MJ Un conjunto de herramientas optogenéticas para la resistencia a los antibióticos inducibles por la luz. Nat Comun 14, 1034 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36670-2

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Recibido: 10 junio 2022

Aceptado: 13 febrero 2023

Publicado: 23 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36670-2

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