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Dec 30, 2023

Un dispositivo de diagnóstico de microfluidos con tapón de aire

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 12852 (2022) Citar este artículo

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La identificación de la contaminación accidental con alérgenos en los alimentos procesados ​​es crucial para las estrategias de gestión de riesgos en la industria de procesamiento de alimentos para prevenir de manera efectiva los incidentes de alergia alimentaria. Aquí, proponemos una válvula de cierre pasiva de nuevo diseño con rendimiento de alta resistencia a la presión denominada "válvula de conexión de aire" para mejorar aún más los dispositivos de microfluidos para la detección de ácidos nucleicos objetivo. Al implementar la válvula de conexión de aire como una válvula de cierre permanente, se podría lograr un índice de flujo máximo permitido de 70 µL/min para la dispensación secuencial de líquido en una matriz de 10 microcámaras, que es 14 veces mayor que la alcanzada con la válvula anterior. disposición mediante válvulas de cierre de una sola cara. Además, demostramos la detección simultánea de múltiples alérgenos alimentarios (trigo, trigo sarraceno y cacahuete) basada en el ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle colorimétrico utilizando nuestro dispositivo de diagnóstico con 10 microcámaras dispuestas de forma compacta en un círculo de 20 mm de diámetro. Después de realizar los ensayos a 60 °C durante 60 min, cualquier combinación de los tres tipos de alérgenos alimentarios y plantas de té, que se usaron como muestras de control positivo y negativo, respectivamente, arrojó resultados de prueba correctos, sin contaminación cruzada entre las microcámaras. . Por lo tanto, nuestro dispositivo de diagnóstico proporcionará una plataforma rápida y fácil de muestra a respuesta para garantizar la seguridad y la seguridad alimentaria.

Las alergias alimentarias son respuestas adversas inmunomediadas desencadenadas por la inhalación o ingestión de proteínas en alimentos específicos1,2,3. Las tasas de incidencia y prevalencia de las alergias alimentarias han aumentado en las últimas décadas, planteando un problema de salud mundial. Los alérgenos pueden causar no solo reacciones alérgicas agudas, como en la piel (urticaria), el tracto respiratorio (sibilancias, tos) y el tracto gastrointestinal (náuseas, vómitos y diarrea), sino también condiciones críticas, como anafilaxia4,5. En la actualidad, el etiquetado de alérgenos alimentarios es obligatorio y está legislado en muchos países. En Japón, se han adoptado regulaciones de etiquetado de alérgenos alimentarios para alimentos procesados ​​que contienen siete materias primas específicas, que incluyen trigo, trigo sarraceno, maní, huevo, leche, camarones y cangrejo. Las directrices estipulan que cualquier alimento que contenga proteínas alergénicas debe etiquetarse si la concentración supera los 10 mg/kg (ppm)6. Para los consumidores alérgicos a los alimentos, incluso una pequeña cantidad de un alérgeno puede inducir una reacción alérgica7. Por lo tanto, la identificación rápida y fácil de los alimentos procesados ​​contaminados accidentalmente con sustancias alergénicas es crucial para las estrategias de gestión de riesgos en la industria de procesamiento de alimentos para prevenir de manera efectiva los incidentes de alergia alimentaria.

Se han evaluado muchos métodos para detectar diversos alérgenos alimentarios8. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se usa ampliamente para el análisis cuantitativo de proteínas específicas debido a sus ventajas de alta sensibilidad, alta especificidad, facilidad de uso y alto rendimiento de muestras. Por ello, es uno de los ensayos más utilizados para la detección y cuantificación de alérgenos alimentarios en la industria alimentaria y en los organismos oficiales de control alimentario9,10. Varios kits de pruebas de inmunodiagnóstico basados ​​en ELISA están disponibles comercialmente para la detección de alérgenos alimentarios11,12,13. Sin embargo, las proteínas son susceptibles a la degradación proteolítica involuntaria durante los procesos de extracción utilizados en los métodos de detección basados ​​en proteínas, lo que puede provocar resultados falsos negativos, y las matrices alimentarias complejas pueden contener componentes orgánicos que interfieren, lo que puede dar lugar a falsos positivos14,15. Debido a que las moléculas de ADN son más estables que las proteínas, los métodos de detección basados ​​en ácidos nucleicos, entre los cuales la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) es el método más utilizado para amplificar objetivos de ácidos nucleicos específicos (ADN/ARN), se utilizan cada vez más. en la detección de alérgenos alimentarios16,17,18,19. Sin embargo, las pruebas de qPCR requieren personal altamente capacitado y equipos costosos (es decir, un termociclador) con un control preciso del punto de ajuste de la temperatura para la amplificación y, por lo tanto, no es una herramienta de detección rentable y fácil de usar.

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) ha sido reconocida como una alternativa a la qPCR para la detección in situ sin necesidad de equipo especializado20,21. El ensayo LAMP, en el que se utiliza un conjunto de cuatro a seis cebadores LAMP diseñados específicamente y polimerasa de ADN Bst con alta actividad de desplazamiento de cadena para amplificar un objetivo de ADN específico, se puede realizar en 30-60 min en condiciones isotérmicas (60-65 ºC)22,23. Hay varios métodos disponibles para detectar los productos de amplificación LAMP, como la visualización de los productos de amplificación a través de la electroforesis en gel tradicional después de la amplificación, la medición en tiempo real de la turbidez causada por el pirofosfato de magnesio que se produce como subproducto de la reacción y la detección en tiempo real de los amplicones LAMP utilizando un colorante fluorescente intercalado (p. ej., SYBR Green I). Además, es posible la detección colorimétrica a simple vista mediante el uso de colorantes indicadores. Por ejemplo, el rojo de fenol es un tinte indicador sensible al pH que se usa para monitorear cambios significativos de pH de alcalino a ácido asociado con la reacción LAMP y el azul de hidroxinaftol (HNB) es un tinte indicador de metal que se usa para monitorear una disminución rápida en la concentración de Mg2+ libre. iones debido a la formación de pirofosfato de magnesio insoluble durante la amplificación del ADN24,25,26. Sin embargo, existen problemas fundamentales con el método LAMP convencional que quedan por resolver para su aplicación en el diagnóstico multiplexado in situ de múltiples alérgenos alimentarios. Es decir, es necesario preparar y analizar individualmente muchas mezclas de muestra/reactivo para cada objetivo de alérgeno alimentario. Este procedimiento requiere no solo una preparación larga y tediosa de la muestra para obtener un resultado de la prueba, sino también una cantidad relativamente grande de reactivos LAMP, por lo general, de 10 a 25 µl para analizar un solo alérgeno alimentario. Para abordar estas preocupaciones, las tecnologías Lab-on-a-chip tienen un potencial considerable para permitir ensayos LAMP multiplexados en dispositivos microfluídicos para la detección simultánea de ácidos nucleicos específicos en una sola operación27,28,29,30,31,32,33,34 .

En nuestros estudios anteriores35,36,37, desarrollamos un dispositivo de microfluidos versátil para la detección multiplexada de ácidos nucleicos específicos basados ​​en el método LAMP. El dispositivo de microfluidos permite la dispensación secuencial de mezclas de muestra/reactivo en una serie de microcámaras de reacción con una sola operación, lo que posiblemente brinde una plataforma para diagnósticos rápidos y sencillos de muestra a respuesta. Con el objetivo de minimizar las pérdidas de cosechas y garantizar un suministro estable de alimentos asequibles en la agricultura, demostramos la capacidad del dispositivo de diagnóstico fabricado para detectar no solo un virus vegetal de ADN que infecta al tomate, sino también cuatro virus vegetales de ARN que infectan a las cucurbitáceas en un plazo de 60 min35. Además, demostramos que la planta tóxica Colchicum autumnale podría detectarse en 60 minutos para proporcionar un método de detección confiable para el envenenamiento por plantas en la atención médica de emergencia36. Además, podemos diagnosticar simultáneamente la enfermedad por coronavirus y otras enfermedades infecciosas, incluidas las causadas por el síndrome respiratorio agudo severo, la influenza A estacional y la influenza pandémica A 2009, ejecutando un ensayo LAMP colorimétrico de transcripción inversa durante 30 minutos con nuestro dispositivo de microfluidos37. Sin embargo, en el método de dispensación de líquido secuencial propuesto anteriormente, el caudal máximo permisible para dispensar microcámaras múltiples está limitado por un aumento en la resistencia al flujo, que aumenta en proporción no solo al caudal, sino también al número de microcámaras llenas. En este estudio, diseñamos una nueva configuración de válvula para usar como válvula de cierre permanente (en lo sucesivo, "válvula de conexión de aire") en el dispositivo de diagnóstico microfluídico con el objetivo de mejorar significativamente el rendimiento de la dosificación secuencial de líquido en una matriz de microcámaras de reacción. La característica más distintiva de la válvula plug-in de aire propuesta aquí es que los líquidos que llegan a un conjunto de dos válvulas pasivas se empujan entre sí a través del tapón de aire, lo que da como resultado un rendimiento de alta resistencia a la presión porque la presión aplicada se compensa. Utilizando un dispositivo de microfluidos de diseño óptimo con 10 microcámaras dispuestas en un círculo, demostramos la detección simultánea de tres alérgenos alimentarios basados ​​en objetivos de ADN específicos de trigo (Triticum aestivum), trigo sarraceno (Fagopyrum esculentum) y maní (Arachis hypogaea).

Desarrollamos un proceso de fabricación de un dispositivo de microfluidos basado en polidimetilsiloxano (PDMS) empleado para la detección genética multiplexada, que combina un proceso de litografía suave y un proceso de reflujo de cera38. La Figura 1a muestra un ejemplo del dispositivo microfluídico fabricado (con un tamaño de 50 mm × 25 mm) que consta de dos partes principales: una región de mezcla y una región de dispensación, que también sirven como regiones de reacción y detección. Cinco microcámaras en una matriz están interconectadas a través de dos microcanales rectangulares independientes (200 µm de ancho y 50 µm de altura) para introducir el líquido en las microcámaras y para expulsar el aire de las microcámaras, respectivamente.

Representación esquemática del dispositivo de diagnóstico de microfluidos que permite la dispensación secuencial de líquido para la detección de alérgenos genéticos multiplexados y fabricado mediante una combinación de un proceso de litografía blanda y un proceso de reflujo de cera. (a) Se llenó con agua de color verde un dispositivo de microfluidos PDMS fabricado que constaba de una serie de cinco microcámaras de reacción (~ 3 µL cada una). (b) Se colocó un trozo de cera en la superficie superior de cada patrón de molde de cámara SU-8. (c) Moldes de cera en forma de semielipsoide formados con una forma uniforme después de calentar a 135 °C durante 3 min. ( d ) Imágenes de microscopía electrónica de barrido de la microcámara PDMS. ( e ) Imagen 3D y perfiles transversales de la microcámara PDMS.

El proceso de fabricación utilizado se puede describir brevemente de la siguiente manera: primero, se modeló una fotorresistencia negativa gruesa (SU-8 3050; MicroChem, Newton, MA, EE. UU.) en una oblea de silicio monocristalino de 4 pulgadas (e-Prize, Yokohama, EE. UU.). Japón) como un molde en un proceso de fotolitografía de un solo paso. A continuación, para crear estructuras de microcámaras profundas y localizadas (máx. 1 mm de profundidad), se usaron simultáneamente el molde SU-8 y piezas de cera de 2,7 mg (Ferris File-A-Wax; Freeman Manufacturing & Supply, Avon, OH, EE. UU.). sometido a un tratamiento superficial de plasma de aire a baja presión en un asher de plasma (JPA300; J-Science Lab, Kyoto, Japón) a una potencia de 150 W durante 2 min. Luego, las piezas de cera se colocaron en el centro de la superficie superior de cada patrón de cámara SU-8 (Fig. 1b). Posteriormente, se realizó un proceso de reflujo calentando el molde que contenía las piezas de cera en una placa calefactora a 135 °C durante 3 min (EC1200-N; AS ONE, Osaka, Japón). Después de enfriar a temperatura ambiente, se obtuvieron moldes de cámara en forma de semielipse con una forma uniforme debido a la tensión superficial de la cera fundida (Fig. 1c). Cabe señalar que el tratamiento superficial con plasma del molde SU-8 y las piezas de cera antes del proceso de reflujo mejoró notablemente la fuerza de adhesión entre ellos, probablemente debido a la eliminación de contaminaciones superficiales. Posteriormente, el molde maestro SU-8 con las estructuras de cera semielípticas se replicó en PDMS (Silpot 184; Dow Corning Toray, Tokio, Japón) después de curar en una placa caliente a 80 °C durante 40 min. Después de despegar el PDMS del molde maestro SU-8, se perforaron orificios circulares (con un diámetro de 1,0 mm) para una entrada y dos puertos de salida en el dispositivo de microfluidos PDMS utilizando una herramienta perforadora de biopsia (Kai Industries, Gifu, Japón). ). Finalmente, tanto las microcámaras como los microcanales se sellaron con una lámina blanca de cloruro de polivinilo (PVC) (EB-235; Hikari, Osaka, Japón) utilizando una cinta adhesiva de doble cara a base de silicona (No. 5303 W; Nitto Denko, Osaka, Japón). Japón). La Figura 1d muestra imágenes de una microcámara de PMDS adquiridas con un microscopio electrónico de barrido (S-3000 N; Hitachi High-Tech, Tokio, Japón). Se obtuvo una microcámara de PDMS tridimensional (3D) con una superficie curva extremadamente suave. Una imagen 3D y perfiles transversales de la microcámara PDMS adquirida con un microscopio digital (VHX-7000; Keyence, Osaka, Japón) revelaron que la profundidad máxima de la microcámara semielíptica PDMS era de aproximadamente 1 mm, el valor de diseño esperado (Fig. 1e).

En este estudio, también se fabricaron mediante el mismo proceso dispositivos de microfluidos con 10 microcámaras dispuestas en una sola fila o en un círculo. Además, para investigar el efecto de la fuga de aire en la interfaz del dispositivo PDMS y la cinta adhesiva de doble cara a base de silicona, preparamos un dispositivo PDMS modificado que se unió covalentemente a una capa delgada de PDMS recubierta por rotación en una pantalla de 4 pulgadas. oblea de vidrio (AS-4; Toshin Riko, Tokio, Japón) mediante tratamiento superficial con plasma de aire. En experimentos, una bomba de jeringa (YSP-201; YMC, Kyoto, Japón) o una microbomba accionada por presión (Flow EZ 7000 mbar, Fluigent SA, Le Kremlin-Bicêtre, Francia) equipada con un sensor de flujo (Flow Unit, Fluigent SA ) se utilizaron para introducir el líquido en los dispositivos. Se utilizó la cámara de un teléfono inteligente para capturar imágenes de video del proceso secuencial de dispensación de líquido en múltiples microcámaras y fotografías de múltiples microcámaras para analizar el cambio de color después de los ensayos LAMP.

En nuestro estudio anterior37, introdujimos un método de dispensación secuencial de líquido en múltiples microcámaras de reacción mediante el control de las presiones de ruptura en un par de válvulas de cierre pasivas integradas en cada microcámara (Fig. 2). En resumen, el procedimiento de dispensación fue el siguiente: primero, el flujo de líquido se detiene después de llegar a la válvula de cierre pasiva S1 (diseñada con presión de ruptura P1), que actúa como una válvula de cierre temporal y se redirige hacia la microcámara. Después de llenar la microcámara con líquido, el flujo de líquido se detiene en la válvula de cierre pasiva S2 (diseñada con presión de ruptura P2), que actúa como una válvula de cierre permanente, y luego el líquido fluye hacia la segunda microcámara pasando a través de la válvula. S1 porque P1 < P2. La válvula S2 también ayuda a expulsar el aire de las microcámaras. Todas las microcámaras pueden llenarse secuencialmente con líquido repitiendo este proceso. En el proceso de dosificación, el número posible de microcámaras dosificadas y el caudal máximo permisible pueden ser diseñados teóricamente por la teoría secuencial de dosificación de líquidos que sugerimos y que se describe mediante la siguiente ecuación:

donde ΔP(L1), ΔP(L2) y ΔP(L3) son las diferencias de presión requeridas para hacer fluir un líquido en microcanales con longitudes características L1, L2 y L3, respectivamente, y m es el número de microcámaras que han sido completamente completado. Las definiciones de L1, L2 y L3 se dan en la siguiente sección. La resistencia al flujo dentro de la microcámara no se considera porque la microcámara tiene un espacio considerablemente mayor que los microcanales. La caída de presión teórica ΔP(L) en un microcanal rectangular viene dada por la siguiente ecuación39:

donde W, H y L son el ancho, la altura y la longitud del microcanal, respectivamente, η es la viscosidad dinámica del líquido (η = 1 mPa·s para el agua) y Q es el caudal volumétrico.

Representación esquemática de un método de dispensación secuencial de líquido en múltiples microcámaras de reacción. (a) Diseño detallado de microcámaras con un par de válvulas de cierre de una sola cara con diferentes presiones de ruptura. (b) Imagen de microscopía óptica de la válvula de cierre permanente S2. ( c ) Imagen de microscopía óptica de la válvula de cierre temporal S1.

De acuerdo con la teoría de dosificación (Ec. 1), para aumentar el caudal para el mismo número posible de microcámaras dosificadas, se requiere reducir la longitud del microcanal, en particular L1, disminuir la presión de ruptura P1 de la válvula de cierre temporal S1, y aumentar la presión de rotura P2 de la válvula de cierre permanente S2, reduciendo así el tiempo necesario para dispensar líquido en las microcámaras. La presión de rotura teórica, P(g) (Pa), de la válvula S1 se describe a continuación37:

donde g es el espacio entre la pared lateral vertical del microcanal y la estructura convexa incrustada en la pared lateral opuesta (en lo sucesivo denominada "válvula de cierre de una sola cara"), H es la altura del microcanal, θm es el ángulo de contacto con el agua para las superficies superior y lateral del microcanal en un espacio estrecho (θm = 108° para PDMS), θf es el ángulo de contacto con el agua para la superficie inferior del microcanal (θf = 102° para la cinta adhesiva de doble cara a base de silicona ), y γ es la tensión superficial del líquido (γ = 0,073 N/m para el agua). Cuando el radio de esquina r en el borde posterior de la estructura convexa no es despreciable, el denominador g + r (1 ‒ cos β) en el primer término es la distancia redefinida entre una cierta posición en la esquina en un ángulo β y el pared lateral vertical del microcanal, donde β es el ángulo entre la dirección perpendicular a la dirección longitudinal del microcanal y la posición del menisco líquido-aire correspondiente a estar clavado en la esquina de la estructura convexa. En este estudio, investigamos configuraciones de válvula de nuevo diseño para la válvula de cierre permanente S2 para mejorar el rendimiento de resistencia a la presión. Analizamos el rendimiento teórico y experimental de la dispensación secuencial de líquido en una matriz de microcámaras mediante la implementación de una válvula de cierre de doble cara o una válvula de complemento de aire (los diseños de las dos válvulas se describen en detalle en la siguiente sección) y lo comparamos con la de la válvula de cierre de una sola cara reportada en nuestro estudio previo37.

El objetivo de este estudio fue presentar una plataforma rápida y fácil de muestra a respuesta para la detección multiplexada de múltiples alérgenos en alimentos procesados ​​en una sola operación. Exploramos la posibilidad de la detección simultánea de tres objetivos de ADN específicos de trigo, trigo sarraceno y maní utilizando nuestro dispositivo de diagnóstico microfluídico recientemente diseñado con 10 microcámaras dispuestas en un círculo. El procedimiento operativo para el ensayo LAMP colorimétrico multiplexado en el dispositivo de diagnóstico microfluídico para la detección genética simultánea de los tres alérgenos es el siguiente (Fig. S1 complementaria): primero, 0,5 µL de tres conjuntos de cebadores específicos diseñados para amplificar los genes de alérgenos de plantas objetivo (No. 2 y 7 para trigo; No. 3 y 8 para trigo sarraceno; y No. 4 y 9 para maní) y 0.5 µL de juegos de cebadores universales para identificar todas las especies de plantas como control positivo (No. 5 y 10) fueron pre-manchado y secado en cada cámara de reacción (volumen ≈ 3 μL) en una placa caliente a 80 °C durante 3 min. Posteriormente, tanto las microcámaras como los microcanales de la superficie del PDMS se sellaron con una lámina de PVC utilizando una cinta adhesiva de doble cara a base de silicona. Después de dispensar una mezcla de muestra de ADN y reactivos LAMP en las múltiples cámaras de reacción a una velocidad de flujo de 30 µL/min usando la bomba de jeringa, los puertos de entrada y salida se sellaron con una cinta adhesiva de doble cara a base de silicona junto con una lámina de polietileno. forro de liberación de tereftalato en un lado. Aquí, el revestimiento de liberación se lamina en ambos lados para cubrir las capas adhesivas de la cinta de doble cara. El dispositivo de microfluidos se sujetó mecánicamente entre dos placas de vidrio (S9213; Matsunami Glass, Osaka, Japón) colocadas a ambos lados del dispositivo para evitar fugas en las interfaces entre la lámina de PVC, el PDMS y el revestimiento de liberación de tereftalato de polietileno. Para evitar la deformación del dispositivo por el recorte mecánico, el dispositivo PDMS se intercaló entre dos placas de vidrio adicionales. Finalmente, el dispositivo se sumergió en un baño de agua caliente (TB-2N; AS ONE, Osaka, Japón) para amplificar el ADN objetivo mediante la reacción LAMP en condiciones isotérmicas a 60 °C durante 60 min.

Se utilizó HNB (FUJIFILM Wako Pure Chemical, Osaka, Japón) como indicador para la detección colorimétrica visible de la reacción LAMP y para el análisis de imágenes para la cuantificación del color de punto final. En nuestro estudio anterior37, desarrollamos un método para evaluar cuantitativamente las diferencias de color entre una reacción positiva (azul cielo) y una reacción negativa (violeta) después de los ensayos LAMP, basado en una representación del espacio de color CIE L*a*b* ( CIELAB). En el espacio de color CIELAB, L* indica luminosidad, y a* y b* son coordenadas de cromaticidad. En resumen, primero, los valores RGB para cada microcámara se cuantificaron usando ImageJ (versión 1.52a, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.) a partir de fotografías tomadas con la cámara de un teléfono inteligente y luego se convirtieron a valores triestímulo XYZ en el color CIE XYZ. espacio. Los valores de los parámetros de color L*, a* y b* se calcularon utilizando los valores XYZ. Este método de cálculo ha sido previamente descrito detalladamente40. Se añadió HNB a la mezcla de muestra de ADN y reactivos LAMP en cada cámara de reacción a una concentración final de 150 µM. Se empleó el kit de amplificación de ADN Loopamp (Eiken Chemical, Tokio, Japón), que incluye una mezcla de reacción 2x ​​y una polimerasa de ADN Bst termoestable, para realizar las reacciones LAMP. El ADN se extrajo de trigo, trigo sarraceno, maní y planta de té (Camellia sinensis; utilizada como control negativo) con un kit TaKaRa NucleoSpin Plant II (Takara Bio, Shiga, Japón) y se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific , Waltham, MA, EE. UU.). Se obtuvieron del jardín botánico cuatro muestras de plantas, incluidas T. aestivum (bono n.° JU2021TA10), F. esculentum (bono n.° JU2021FE11), A. hypogaea (bono n.° JU2021AH12) y C. sinensis (bono n.° JU2021CS13). de la Universidad Josai. Todos los especímenes fueron depositados en el jardín botánico de la Universidad Josai.

En nuestros estudios previos35,36,37, usamos perlas de polímero hemisféricas (2 mm de diámetro; SAYAKOBO, Yokohama, Japón) para crear estructuras de microcámaras profundas y localizadas en lugar del proceso de reflujo de cera (Figura complementaria S2). Las perlas de polímero se pegaron manualmente en cada patrón de cámara SU-8 como un molde utilizando un adhesivo epoxi (Araldite; Huntsman Japan, Kobe, Japón) a temperatura ambiente durante 12 h. Este proceso de fabricación condujo a una baja reproducibilidad de las microcámaras, es decir, la baja capacidad de control del grosor de la capa adhesiva y el exceso de adhesivo que se exprimió en la interfaz de unión disminuyó la precisión de la replicación, particularmente en la intersección del microcanal y la entrada de la microcámara. Tales fallas en el proceso a veces llevaron a que burbujas de aire inesperadas quedaran atrapadas en la microcámara (Fig. 3a). Este resultado desfavorable probablemente fue causado por un flujo no uniforme en un escalón o alrededor de un obstáculo en la entrada de la microcámara. La probabilidad de dispensar muestras sin burbujas de aire fue del 87,0 % en experimentos con 20 dispositivos y un total de 100 cámaras. Al implementar el proceso de reflujo térmico con cera, la probabilidad de dispensar sin burbujas de aire mejoró notablemente hasta en un 100 % en experimentos con 20 dispositivos y un total de 100 cámaras (Fig. 3b).

Comparación de los comportamientos de dispensación de líquido entre las microcámaras de PDMS fabricadas empleando (a) perlas de polímero hemisféricas y (b) el proceso de reflujo de cera. El primero exhibió ocasionalmente burbujas de aire inesperadas atrapadas en las microcámaras, mientras que el segundo no.

En este estudio, mejoramos el rendimiento de resistencia a la presión de la válvula S2 al cambiar su configuración geométrica. Como se muestra en la Fig. 4a, la distancia de separación de la válvula S2 está determinada por dos estructuras convexas enfrentadas incrustadas en ambas paredes laterales del microcanal (denominada válvula de cierre capilar41). En nuestros dispositivos, la estructura de la válvula S2 se denomina en lo sucesivo válvula de cierre de dos caras, mientras que la válvula S1 es una válvula de cierre de una sola cara. La presión de ruptura teórica de la válvula de cierre de dos caras se puede derivar de la siguiente manera:

Resultados experimentales que muestran el efecto del caudal en el rendimiento de la dosificación secuencial de líquido en una matriz de 10 microcámaras con válvulas de cierre de doble cara. (a) Diseño detallado de las microcámaras de reacción con un par de válvulas de cierre pasivas que incluyen una válvula de cierre de una cara como válvula de cierre temporal S1 y una válvula de cierre de dos caras como válvula de cierre permanente S2. Las microcámaras se llenaron secuencialmente con agua de color azul a un caudal de (b) 10, (c) 20 o (d) 50 µL/min.

Se midió experimentalmente que la distancia de separación de la válvula de cierre de dos caras S2 era g2 = 21,4 μm (Fig. 4), lo que resultó en una presión de ruptura teórica P2 de 5,85 kPa para r2 = 6,4 μm en un microcanal (W = 202,1 μm y H = 59,0 µm). Se calculó que la presión de ruptura teórica de la válvula de cierre de una sola cara con la misma distancia de separación (g2 = 21,4 μm) era P2 = 4,47 kPa. Por lo tanto, la presión de rotura se puede aumentar 1,3 veces en comparación con la de la válvula de cierre de una cara implementando la válvula de cierre de dos caras para S2. Cabe señalar que cinco pares de S2 se colocaron en serie (Fig. 4a) porque asumimos que la distancia de separación (g2) y/o el radio de esquina (r2) de una o más válvulas no sería el valor de diseño debido a cambios inesperados. fallos de proceso en litografía blanda. Por lo tanto, la válvula de las cinco que tiene la presión de ruptura más alta (P2) determina el límite de rendimiento real de la válvula en dispositivos microfluídicos. A modo de comparación, la distancia de separación g1 de 40,5 μm para la válvula de cierre de una sola cara S1 dio como resultado una presión de rotura teórica P1 de 2,79 kPa. Las longitudes de los microcanales L1, L2 y L3 se establecieron en 5,0 mm, 1,0 mm, 0,2 mm, como se muestra en la Fig. 4a.

La Figura 4b muestra que una matriz de 10 microcámaras se llenó completamente con agua coloreada con colorante alimentario azul (0,1 % p/v) cuando usamos la microbomba impulsada por presión a un caudal de 10 µL/min. Como era de esperar, el número posible de microcámaras dispensadas al usar la válvula de cierre de doble cara S2 aumentó 1,7 veces en comparación con las seis microcámaras que se podían lograr con el mismo caudal con la válvula de cierre de una cara S2 utilizada anteriormente37. Sin embargo, como predijo el modelo de dosificación teórico, la cantidad posible de microcámaras dosificadas disminuyó a cinco y dos cuando el caudal aumentó a 20 µL/min (Fig. 4c y Video S1) o 50 µL/min (Fig. 4d) , respectivamente.

De acuerdo con la teoría de dispensación descrita en las Ecs. (1–4), el caudal máximo permitido está limitado por un aumento en la resistencia al flujo ΔP(L1), que aumenta en proporción no solo al caudal, sino también al número de microcámaras llenas. Al usar las dimensiones geométricas de los microcanales y un par de válvulas de cierre pasivas diseñadas en este estudio, el caudal máximo permitido para dispensar 10 microcámaras se limitó a aproximadamente 10 µL/min. Cabe señalar que una mayor reducción de la distancia de separación (g2 = 20 µm como valor de diseño) de la válvula de cierre permanente S2 mejoraría la resistencia a la presión (P2), pero afectaría negativamente la precisión del patrón del molde SU-8. por fotolitografía.

Por lo tanto, proponemos una configuración de válvula de nuevo diseño para la válvula de cierre permanente, que denominamos "válvula de conexión de aire". Como se muestra en la Fig. 5a, se colocó un conjunto de dos válvulas de cierre de doble cara S2 aguas abajo y aguas arriba en el microcanal superior (en lo sucesivo denominado microcanal de escape de aire) para expulsar el aire de las microcámaras. Se colocaron cinco pares de S2 en serie para evitar el riesgo de fallas inesperadas en el proceso de fabricación como se mencionó en la sección anterior. La característica más distintiva de la válvula plug-in de aire propuesta aquí es que el aire queda atrapado en la parte del microcanal de escape de aire que conecta dos válvulas S2 de microcámaras vecinas cuando la siguiente microcámara está completamente llena de líquido (Fig. 5a). Por ejemplo, ambas válvulas S2 de la primera microcámara están sujetas a la presión total dada en el lado derecho de la ecuación. (5a) mientras la segunda microcámara se llena de líquido. Esta condición corresponde al caso donde m = 1 en Eq. (1), y la presión aplicada a las válvulas S2 alcanza el máximo justo antes de que el líquido llegue a las válvulas S2 de la segunda microcámara. Sin embargo, una vez que se completa el atrapamiento de aire entre las válvulas S2 de la primera y la segunda microcámara, la presión aplicada a las válvulas S2 de la primera microcámara disminuye a la presión dada en el lado derecho de la ecuación. (5b) porque los líquidos que llegan a las dos válvulas se empujan entre sí a través del tapón de aire, lo que provoca la compensación de la presión aplicada.

Resultados experimentales que muestran el efecto del caudal en el rendimiento de la dispensación secuencial de líquido en una matriz de 10 microcámaras con válvulas de conexión de aire. (a) Diseño detallado de las microcámaras de reacción con la válvula plug-in de aire como válvula de cierre permanente S2, que consta de un conjunto de dos válvulas de cierre de doble cara enfrentadas en el microcanal de escape de aire. Las microcámaras se llenaron secuencialmente con agua de color verde a un caudal de (b) 10, (c) 30 o (d) 70 µL/min. LL en las fotografías significa longitud de fuga.

Se puede concluir que la presión de ruptura P2 de las válvulas de cierre permanente S2 debe diseñarse solo para satisfacer la restricción dada por la ecuación. (5a), es decir, se requiere que tengan resistencia al flujo solo hasta que el líquido se haya dispensado completamente en la siguiente microcámara. Esto también significa que se ha eliminado la limitación del número posible de microcámaras dispensadas mediante la implementación de la válvula de conexión de aire para S2.

La Figura 5b–d muestra que las 10 microcámaras se llenaron secuencialmente con agua que contenía colorante verde para alimentos (0,1 % p/v) a velocidades de flujo de 10, 30 y 70 μL/min (Video S2). Por lo tanto, la válvula de conexión de aire permitió una dispensación satisfactoria en las 10 microcámaras a caudales inferiores a 70 μl/min. De acuerdo con la restricción dada por la Ec. (5a), el caudal teórico máximo permitido está limitado a aproximadamente 70 µL/min para dispensar 10 microcámaras dadas las dimensiones geométricas de los microcanales y el par de válvulas de cierre pasivas en el diseño utilizado en este estudio. Por lo tanto, los resultados experimentales coincidieron satisfactoriamente con el caudal máximo permisible predicho teóricamente. El caudal permisible logrado con la implementación de la válvula plug-in de aire fue siete veces mayor que el obtenido con la disposición de válvulas anterior utilizando válvulas de cierre de doble cara y 14 veces mayor que el obtenido con las válvulas de cierre de una sola cara utilizadas en nuestro estudio previo (el caudal máximo permisible fue de 5 μL/min para 10 microcámaras)37. En particular, la espectacular mejora en la resistencia a la presión de las válvulas de cierre permanente nos permitió introducir el líquido manualmente en el dispositivo de microfluidos (Video S3; caudal medio estimado: ~ 40 μL/min).

Inesperadamente, observamos que el menisco líquido-aire, que había sido fijado previamente por la válvula de aire, se filtraba gradualmente aguas abajo y, en la primera microcámara, tanto aguas arriba como aguas abajo, a medida que avanzaba la dispensación (flechas amarillas en la Fig. 5b). -d). Este comportamiento inesperado de fuga de la válvula probablemente se debió a la permeabilidad al gas de PDMS42. La longitud de fuga (LL) pareció aumentar no solo con una posición cada vez más aguas arriba de la válvula en el dispositivo, sino también con un aumento en el caudal. La Figura 6a muestra LL en la válvula de conexión de aire aguas abajo de cada microcámara a caudales de 10–70 µL/min. Los valores de LL se estimaron justo después de llenar completamente la 10ª microcámara. LL disminuyó gradualmente a medida que las válvulas se ubicaron aguas abajo hasta que alcanzó 0,8 mm, después de lo cual disminuyó con una pendiente negativa mayor. Cinco pares de S2 se dispusieron en serie en el microcanal de escape de aire, lo que resultó en una longitud total de 0,8 mm entre el borde posterior de la estructura convexa de la primera válvula (establecida en la posición cero de LL) y el borde posterior de la quinta válvula ( Figura 5a). La región de transición cerca de LL = 0,8 mm probablemente se debió a las diferencias geométricas en el microcanal, es decir, fluctuaciones periódicas en el ancho del microcanal debido a las estructuras convexas enfrentadas incrustadas en ambas paredes laterales del microcanal.

Análisis experimental de longitud de fuga (LL). (a) Valores de LL en la válvula de conexión de aire aguas abajo de cada microcámara a caudales de 10–70 µL/min. Los símbolos abiertos y sólidos en el gráfico representan datos para dispositivos de microfluidos PDMS sellados con cinta adhesiva de doble cara a base de silicona y unidos covalentemente a una capa delgada de PDMS, respectivamente. (b) Los datos del dispositivo PDMS que se unió covalentemente a una capa delgada de PDMS recubierta en una oblea de vidrio de 4 pulgadas se volvieron a representar en función del producto de la presión interna (P) aplicada a cada tapón de aire y el logaritmo natural de tiempo (ln(t)).

Para investigar el efecto de la fuga de aire en la interfaz del dispositivo PDMS y la cinta adhesiva de doble cara a base de silicona, preparamos un dispositivo PDMS modificado que se unió covalentemente a una capa delgada de PDMS recubierta en una oblea de vidrio de 4 pulgadas por aire. tratamiento superficial con plasma. Los valores de LL medidos para el dispositivo PDMS modificado también se representan en la Fig. 6a. Se puede observar que no hubo diferencia significativa entre los dos tipos de dispositivos. Por lo tanto, se produjo una fuga de aire insignificante en la interfaz entre el dispositivo PDMS y la cinta adhesiva. Además, aunque todas las válvulas de conexión de aire S2 estaban sujetas a una presión aplicada descrita en la ecuación. (5b) justo después de que se completó el atrapamiento de aire entre las válvulas adyacentes, el tapón de aire atrapado entre la primera y la segunda microcámara exhibió una presión interna mayor que cualquier otro tapón de aire ubicado aguas abajo (Fig. S3), es decir, la presión interna aumentó con un incremento en el número de microcámaras que habían sido dispensadas, según la Ec. (1). Por lo tanto, se puede considerar que LL aumenta no solo en las válvulas con tapón de aire ubicadas aguas arriba, sino también a una tasa de flujo más alta debido a un aumento en la resistencia del flujo que se puede estimar mediante la ecuación. (2).

En la Fig. 6b, los datos del dispositivo PDMS unido covalentemente a una capa delgada de PDMS recubierta en una oblea de vidrio de 4 pulgadas se vuelven a representar en función del producto de la presión interna (P) aplicada a cada tapón de aire y el logaritmo natural de tiempo (ln(t)). P se calculó teóricamente de acuerdo con la ecuación. (1), y t se determinó experimentalmente como el tiempo total transcurrido entre la finalización de un determinado tapón de aire y el llenado completo de agua de las 10 microcámaras. Los datos se enumeran en la Tabla S1 en la información complementaria. Como se muestra en el gráfico, en condiciones de LL ≥ 0,8 mm, LL se expresa independientemente del caudal y la posición de la válvula de la siguiente manera:

donde el coeficiente de determinación (R2) se estimó en 0,823, lo que indica que el supuesto presentado en la Ec. (6) es válido. Por lo tanto, teóricamente podemos predecir LL incluso durante el proceso de diseño de dispositivos microfluídicos. Cabe señalar que, cuando el bombeo detuvo el flujo de líquido hacia el dispositivo de microfluidos, se retiró la tubería de entrada y se redujo significativamente la fuga de líquido en las válvulas de conexión de aire porque la presión interna tanto en el microcanal como en las microcámaras se redujo inmediatamente. disminuye a la presión atmosférica. Una forma fundamental de superar el problema de las fugas es reemplazar el PDMS con plásticos de ingeniería con menor permeabilidad a los gases, como el polimetilmetacrilato, el policarbonato o el polímero de cicloolefina.

Exploramos la posibilidad de la detección rápida y simultánea de múltiples sustancias alergénicas alimentarias, es decir, objetivos de ADN específicos de trigo (T. aestivum), trigo sarraceno (F. esculentum) y maní (A. hypogaea), mediante el método colorimétrico LAMP utilizando un Dispositivo microfluídico con disposición circular. Con el objetivo de proporcionar un dispositivo de diagnóstico de microfluidos para la detección genética simultánea de siete alérgenos en alimentos procesados, alojamos de forma compacta 10 microcámaras en un círculo en lugar de utilizar un formato de una sola fila. Como se muestra en la Fig. 7, en un dispositivo con una disposición circular, el agua de color verde (0,1 % p/v) podría dispensarse secuencialmente con éxito en todas las microcámaras a un caudal de 30 µL/min (Video S4). Nuestro método de dispensación de líquido secuencial proporciona una flexibilidad sustancial en el diseño de dispositivos microfluídicos, lo que permite el diseño geométrico de 10 microcámaras dispuestas en un círculo y alojadas de forma compacta dentro del diámetro exterior de 20 mm formado por el microcanal de escape de aire. Las dimensiones geométricas de este tipo de dispositivo fueron diseñadas como L1 = 1,52 mm, L2 = 0,80 mm y L3 = 0,89 mm. Se estimó que el caudal máximo permitido teórico para dispensar agua en las 10 microcámaras era inferior a 160 µL/min, las distancias entre espacios eran g1 = 40,5 μm y g2 = 21,4 μm para las válvulas S1 y S2, respectivamente, el radio de la esquina en la parte posterior el borde de las estructuras convexas era r1 = r2 = 6,4 µm, y la anchura y la altura del microcanal eran W = 202,1 µm y H = 59,0 µm, respectivamente.

Dispositivo de microfluidos PDMS de diseño óptimo con 10 microcámaras de reacción (~ 3 µL cada una) dispuestas en un círculo y alojadas de forma compacta dentro del diámetro exterior de 20 mm formado por el microcanal de escape de aire, empleado para la detección genética multiplexada de alérgenos alimentarios. Todas las microcámaras se llenaron secuencialmente con agua de color verde a un caudal de 30 µL/min.

La Figura 8a muestra un resultado experimental para la detección de ADN específico de trigo (concentración de ADN total: 1,0 ng/µL) mediante el método colorimétrico LAMP utilizando el dispositivo de microfluidos. Después de introducir en el dispositivo la muestra de ADN de trigo mezclada con los reactivos LAMP, se realizó el ensayo LAMP en un baño de agua caliente a 60 °C durante 60 min. Como era de esperar, las reacciones positivas, manifestadas por un cambio de color de HNB (150 µM) en la solución de reacción LAMP de violeta a azul cielo, se observaron claramente en las cámaras 2, 5, 7 y 10, sin falsos positivos ni falsos negativos. resultados. Los ensayos LAMP con ADN de trigo sarraceno y ADN de maní arrojaron resultados positivos verdaderos en las cámaras 3 y 8 (Fig. S4a complementaria) y 4 y 9 (Fig. S4b), respectivamente, así como en las cámaras 5 y 10 utilizadas como control positivo.

Fotografías tomadas con la cámara de un teléfono inteligente que muestran la detección colorimétrica de (a) ADN de trigo (núms. 2 y 7), (b) una mezcla de ADN de trigo y trigo sarraceno (núms. 3 y 8), (c) una mezcla de trigo, trigo sarraceno y ADN de cacahuete (Nos. 4 y 9), y (d) ADN de planta de té como control negativo, mediante ensayos LAMP realizados a 60 °C durante 60 min. Los juegos de cebadores universales para identificar todas las especies de plantas se colocaron previamente en las cámaras n.º 5 y 10 como control positivo, mientras que en las cámaras n.º 1 y 6 no se colocaron cebadores previamente como control negativo.

La Figura 8b muestra la detección simultánea de múltiples alérgenos alimentarios en una mezcla de ADN de trigo y ADN de alforfón (concentración de ADN total: 1,0 ng/µL cada uno) mediante el ensayo LAMP; se produjeron reacciones positivas en las cámaras 2, 3, 5, 7, 8 y 10, sin contaminación cruzada. Los ensayos LAMP multiplexados con otras combinaciones de muestras de ADN, es decir, mezclas de ADN de trigo y ADN de maní (Fig. S4c) y ADN de trigo sarraceno y ADN de maní (Fig. S4d), también arrojaron resultados de prueba verdaderos. De manera similar, una mezcla de las tres muestras de ADN (1,0 ng/µL cada una) produjo reacciones positivas en todas las cámaras excepto en las cámaras 1 y 6, que se utilizaron como control negativo (Fig. 8c). Por el contrario, cuando se introdujo en el dispositivo ADN extraído de una planta de té (1,0 ng/µL), se observó un cambio de color de violeta a azul cielo solo en las cámaras de control positivo (Nos. 5 y 10), sin falsos positivos. reacciones en las otras cámaras (Fig. 8d).

La Figura 9 muestra las distribuciones de las diferencias de color trazadas en el plano cromático a* - b* del espacio CIELAB a partir de los resultados LAMP presentados en la Figura 8 (de manera similar, los datos presentados en la Figura S4 se trazan en la Figura complementaria S5). El resultado reveló que los colores de los grupos positivo y negativo estaban claramente separados después de que los ensayos LAMP se realizaron durante 60 minutos, para cualquier combinación de los tres alérgenos alimentarios y la planta del té utilizada como control negativo.

Las distribuciones de color para las reacciones LAMP positivas (azul cielo) y negativas (violeta) (que se muestran en la Fig. 8) se ejecutan para la detección de tres alérgenos alimentarios (trigo, alforfón y maní) y la planta del té como control negativo, graficadas en el a *-b* plano cromático del espacio de color CIELAB. Las reacciones LAMP se llevaron a cabo a 60 °C durante 60 min.

Con el objetivo de mejorar el rendimiento de los dispositivos de microfluidos basados ​​en PDMS empleados para el diagnóstico genético multiplexado rápido y fácil de usar, propusimos una configuración de válvula de nuevo diseño, denominada válvula de conexión de aire. El rendimiento de resistencia a la presión de la válvula de conexión de aire mejoró notablemente después de que se completó el atrapamiento de aire entre las válvulas enfrentadas. Al reemplazar la disposición de válvula anterior que usaba válvulas de cierre de doble cara con válvulas de conexión de aire, que se usaba como una válvula de cierre permanente, el caudal máximo permitido aumentó significativamente hasta 14 veces (~ 70 µL/min) para secuencialmente. dispensar un líquido para llenar una matriz de 10 microcámaras de reacción. Además, la limitación del número posible de microcámaras dispensadas se eliminó implementando la válvula de conexión de aire. Demostramos que el dispositivo de microfluidos fabricado permite la detección simultánea de tres alérgenos de alimentos vegetales (trigo, alforfón y maní) mediante ensayos LAMP colorimétricos ejecutados a 60 °C durante 60 min en una sola operación, sin contaminación cruzada entre las microcámaras de reacción. Cabe señalar que el dispositivo de diagnóstico podría diseñarse con una configuración geométrica de 10 microcámaras de reacción dispuestas en un círculo y alojadas de forma compacta dentro de un diámetro exterior de 20 mm porque nuestro método de dispensación de líquido secuencial proporciona una flexibilidad sustancial en el diseño de dispositivos microfluídicos.

En estudios futuros, para simplificar el procedimiento operativo, seguiremos desarrollando no solo un método para prealmacenar los reactivos LAMP en el dispositivo microfluídico, sino también un dispositivo microfluídico sin bomba basado en una combinación de bombeo centrífugo y válvulas capilares, sin necesidad de para un sistema de bombeo externo (es decir, una jeringa o bomba de presión). El objetivo final es desarrollar una plataforma de diagnóstico rápida y fácil de muestra a respuesta que permita la detección simultánea no solo de los siete ingredientes alergénicos que deben etiquetarse según la ley japonesa, es decir, trigo, trigo sarraceno, maní, huevo, leche, camarones y cangrejo, pero también patógenos transmitidos por los alimentos (p. ej., Salmonella enterica, S. aureus, Campylobacter jejuni y E. coli O157:H7) utilizando nuestro dispositivo de microfluidos para garantizar la seguridad alimentaria. En principio, es posible personalizar de manera flexible el tipo de objetivo de ácido nucleico de interés (ADN/ARN); por lo tanto, esta tecnología altamente versátil se puede aplicar a la detección genética multiplexada in situ no solo de alérgenos, sino también de enfermedades infecciosas causadas por diversos patógenos (virus, bacterias, hongos y parásitos), plantas venenosas y drogas ilegales, sin un necesidad de operaciones laboriosas y múltiples.

Todos los datos relevantes para el estudio se incluyen en el artículo o se cargan como información complementaria.

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Esta investigación fue parcialmente financiada por el Programa de Transferencia de Tecnología Adaptable y Sin Costuras a través de I+D impulsada por objetivos (A-STEP) de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón (JST) con el número de subvención JPMJTM20EG, y el Proyecto Cooperativo para la Investigación Innovadora de la Universidad Tecnológica de Toyohashi. , Japón Los autores desean agradecer a Editage (www.editage.com) por la edición en inglés.

Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad Tecnológica de Toyohashi, Toyohashi, Aichi, 441-8580, Japón

Daigo Natsuhara, Ryogo Saito, Koki Shirai, Shunya Okamoto, Moeto Nagai y Takayuki Shibata

Facultad de Farmacia y Ciencias Farmacéuticas, Universidad Josai, Sakado, Saitama, 350-0295, Japón

Sae Misawa y Masashi Kitamura

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Todos los autores contribuyeron por igual al manuscrito. DN: metodología, investigación, redacción—preparación del borrador original, SM: metodología, investigación, RS: metodología, investigación, KS: metodología, investigación, SO: redacción—revisión y edición, supervisión, MN: redacción—revisión y edición, supervisión, MK: redacción—revisión y edición, supervisión, adquisición de fondos, TS: conceptualización, redacción—revisión y edición, supervisión, administración de proyectos, adquisición de fondos.

Correspondencia a Daigo Natsuhara o Takayuki Shibata.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Natsuhara, D., Misawa, S., Saito, R. et al. Un dispositivo de diagnóstico microfluídico con válvulas de aire para la detección genética simultánea de varios alérgenos alimentarios. Informe científico 12, 12852 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16945-2

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Recibido: 27 de marzo de 2022

Aceptado: 19 julio 2022

Publicado: 27 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16945-2

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