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Dec 04, 2023

Disbiosis cutánea y biopelícula de Cutibacterium acnes en lesiones inflamatorias de acné en adolescentes

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 21104 (2022) Citar este artículo

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El acné vulgar es un trastorno inflamatorio común que afecta a más del 80% de los adolescentes jóvenes. Cutibacterium acnes juega un papel en la patogenia de las lesiones del acné, aunque los mecanismos son poco conocidos. El estudio tuvo como objetivo explorar el microbioma en diferentes sitios de la piel en el acné adolescente y el papel de la producción de biopelículas en la promoción del crecimiento y la persistencia de aislados de C. acnes. El análisis de la microbiota mostró una diversidad alfa significativamente menor en las lesiones inflamatorias (LA) que en las lesiones no inflamatorias (NI) de pacientes con acné y sujetos sanos (HS). Las diferencias a nivel de especie fueron impulsadas por la sobreabundancia de C. acnes en LA que en NI y HS. El filotipo IA1 estuvo más representado en la piel de pacientes con acné que en HS. Los genes implicados en el transporte y el metabolismo de los lípidos, así como los posibles factores de virulencia asociados con la colonización del tejido del huésped, se detectaron en todas las cepas IA1 independientemente del sitio de aislamiento. Además, los aislamientos IA1 fueron más eficientes en la adhesión temprana y la producción de biomasa que otros filotipos, mostrando un aumento significativo en la tolerancia a los antibióticos. En general, nuestros datos indican que la disbiosis específica del sitio en LA y la colonización por filotipos virulentos y altamente tolerantes de C. acnes pueden contribuir al desarrollo del acné en una parte de la población, a pesar del transporte universal del microorganismo. Además, los nuevos agentes antimicrobianos, dirigidos específicamente a C. acnes que forma biopelículas, pueden representar tratamientos potenciales para modular la microbiota de la piel en el acné.

El acné vulgar es un trastorno inflamatorio crónico de la piel de la unidad pilosebácea que afecta al 67-95 % de los adolescentes en todo el mundo1,2,3. En adultos ha aumentado su prevalencia e incidencia, especialmente entre las mujeres4,5,6. El impacto psicológico del acné es sustancial, provocando un impacto perjudicial en la calidad de vida7,8. El acné se caracteriza por un aumento de la producción de sebo, lo que da lugar a comedones no inflamatorios (NI) y lesiones inflamatorias (LA) como pápulas, pústulas o nódulos, principalmente en la cara y en la espalda y el tórax9. La etiología se asocia a cambios en la producción de sebo bajo control androgénico, alteración del proceso de queratinización y aumento de la liberación de mediadores inflamatorios10,11,12,13. La disbiosis y la colonización folicular por Cutibacterium acnes se han relacionado con la fisiopatología del acné inflamatorio14,15. Sin embargo, el papel de C. acne sigue sin estar claro debido a su distribución ubicua tanto en las áreas sebáceas de la piel sana como en las lesiones inflamatorias del acné y su densidad muy variable en la piel de diferentes individuos15. Aunque generalmente se considera una bacteria de baja virulencia y un comensal de la piel humana, C. acnes puede considerarse un patógeno oportunista asociado con infecciones invasivas de la piel y los tejidos blandos e infecciones asociadas a implantes16,17,18. De hecho, C. acnes, al producir múltiples factores de virulencia como lipasas, proteasas y los factores de Christine Atkins Munch-Petersen (CAMP), puede desencadenar inflamación y daño al tejido del huésped19,20,21,22,23,24. Además, la proliferación de C. acnes en la unidad pilosebácea puede inducir la regulación positiva de diferentes citocinas proinflamatorias por parte de queratinocitos, sebocitos o células mononucleares de sangre periférica25,26,27,28. Las cepas de C. acnes se clasifican en los seis filotipos IA1, IA2, IB, IC, II y III, correlacionados con una distribución corporal variable, condiciones clínicas, perfil de susceptibilidad antimicrobiana y propiedades inflamatorias29,30,31,32. C. acnes IA1 es el filotipo predominante aislado del acné moderado a severo. Por el contrario, los filotipos IB, II y III se aíslan más comúnmente de tejidos blandos e infecciones de implantes médicos33,34,35. En particular, los aislados de IA1 exhiben un perfil más virulento, incluida una mayor producción de β-defensina 2 a partir de queratinocitos cultivados y niveles de actividad de lipasa más altos que otros filotipos asociados con una piel sana36,37. Estas observaciones sugieren que la aparente pérdida de diversidad de filotipos en pacientes con acné y el predominio de cepas virulentas IA1 pueden reflejar un cambio disbiótico dentro de un folículo relacionado con cambios en el microambiente38. En particular, la producción de biopelículas se ha relacionado con filotipos específicos de C. acnes, lo que sugiere una posible asociación con la colonización crónica de la unidad pilosebácea observada en pacientes con acné39,40,41,42. Trabajos anteriores han demostrado que C. acnes forma biopelículas en los folículos de los pacientes con acné43, lo que sugiere que esta condición puede conducir a un desequilibrio homeostático de la microbiota15. De hecho, la persistencia bacteriana crónica y la recaída después de la terapia con antibióticos son fuertemente indicativas de la colonización relacionada con el biofilm44. Aunque la biopelícula se considera un factor principal que asegura la persistencia de C. acnes durante el tratamiento antibiótico del acné 45, aún no se han identificado los factores que promueven la adhesión temprana de bacterias y la formación de biopelículas46. Este estudio analizó el proceso de colonización por C. acnes y su relación con la microbiota cutánea en pacientes con acné severo de NI y LA y sujetos sanos (HS). Además, utilizando un enfoque metagenómico, caracterizamos los antecedentes genéticos y la producción de biopelículas dependiente del filotipo de aislados de C. acnes con respecto a la dinámica de la adherencia temprana, la cantidad total de biomasa de biopelículas y la morfología. Finalmente, también investigamos la contribución de la biopelícula a la tolerancia a los antibióticos de los aislados de C. acnes.

Se incluyeron en el estudio un total de diez pacientes afectados por acné vulgar grave y diez sujetos control sanos (HS), sin antecedentes de acné. Los dos grupos fueron emparejados por edad y sexo. Las características demográficas y clínicas se resumen en la tabla 1.

Análisis de 2 275 010 lecturas (número mínimo de lecturas: 43 111; número máximo de lecturas: 187 496) agrupadas en 2037 taxones. En concreto, se recogieron 2.139.830 lecturas agrupadas en 916 taxones tras filtrar singletons y taxones con una prevalencia inferior al 5%. Después de la rarefacción a una profundidad de muestra de 40 000 lecturas, se recuperaron 880 taxones y se evaluó la diversidad alfa y beta. Se excluyeron dos muestras de los 10 controles sanos debido a la baja calidad y al tamaño de la biblioteca.

La diversidad alfa de la piel de diez sujetos sanos (HS) y las lesiones no inflamatorias (NI) e inflamatorias (LA) de diez pacientes con acné se evaluó utilizando el índice de diversidad de Shannon y el índice de uniformidad de Pielou. Curiosamente, se observó una disminución significativa (P = 0,0002) en el índice de Shannon tanto en NI (media ± SD = 2,39 ± 0,41) como en LA (media ± SD = 1,86 ± 0,26) en comparación con HS (media ± SD = 2,95 ± 0,39) , (Figura 1a). De manera similar, se informó una disminución significativa (P = 0,0004) en el índice de Pielou en las muestras NI (media ± SD = 0,45 ± 0,07) y LA (media ± SD, 0,37 ± 0,05) que en HS (media ± SD, 0,54 ± 0,07) , (Figura 1a). La diversidad beta de Bray Curtis, representada como análisis de coordenadas principales (PCoA), corroboró hallazgos anteriores que muestran una agrupación espacial distintiva de muestras de HS y sujetos con LA (prueba PERMANOVA: P = 0.001, R2 = 0.3522) (Fig. 1b).

La pérdida de diversidad caracteriza el acné inflamatorio. La microbiota cutánea se evaluó en muestras recogidas de la piel de diez sujetos sanos (HS) y lesiones no inflamatorias (NI) e inflamatorias (LA) de diez pacientes con acné. (a) La diversidad alfa se calculó utilizando el índice de diversidad de Shannon (HS frente a NI, P = 0,0209; HS frente a LA, P < 0,0001; LA frente a NI, P = 0,0118) y el índice de uniformidad de Pielou (HS frente a NI, P = 0,0241; HS vs LA, P < 0,0001; LA vs NI, P = 0,0136). Las diferencias estadísticas se determinaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis. ( b ) La diversidad beta de Bray Curtis se calculó a nivel de género y se representó como análisis de coordenadas principales (PCoA). Se utilizó la prueba PERMANOVA para evaluar la significancia. *, P < 0,05; **, p < 0,01; ***, P < 0,001, ****, P < 0,0001.

Se identificaron importantes diferencias dependientes del sitio en la abundancia bacteriana a nivel de filo y género (Fig. 2). La abundancia relativa de Actinobacteria aumentó en las muestras de LA en comparación con lo observado para Firmicutes y Proteobacteria (Fig. 2a). En consecuencia, la abundancia relativa de Actinobacteria representó el 30 % de la comunidad microbiana en HS, el 38 % en NI y aumentó al 71 % en LA (P < 0,001). De manera diferente, Firmicutes y Proteobacteria aparecieron más abundantes en HS (38% y 32%) y NI (32% y 29%) en comparación con LA (13%, 5%).

Variación de la microbiota entre sujetos sanos y pacientes con acné. La microbiota cutánea se evaluó en muestras recogidas de la piel de diez sujetos sanos (HS) y lesiones no inflamatorias (NI) e inflamatorias (AL) de 10 pacientes con acné. Las abundancias relativas a nivel de phylum (a) y los ocho géneros principales (b) se representaron en un gráfico de barras apiladas. (C). Se evaluó la abundancia relativa a nivel de especie para las abundancias relativas de Cutibacterium acnes, Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. La significancia se evaluó utilizando la prueba estática de Kruskal Wallis. *, P < 0,05; **, p < 0,01; ***, P < 0,001, ****, P < 0,0001.

Un punto que vale la pena señalar es que NI apareció más variable que los especímenes de HS y LA, especialmente con respecto a las abundancias de Firmicutes y Proteobacteria. La relación inversa observada para Firmicutes y Actinobacteria phyla se confirmó analizando los diez géneros principales (Fig. 2b). La diferencia más dramática fue la dominancia de Propionibacterium y la reducción en la abundancia relativa del género Staphylococcus en LA en comparación con HS y NI. A nivel de especie (Fig. 2c), Cutibacterium acnes mostró una diferencia significativa entre diferentes sitios (P < 0.0001). Por el contrario, la abundancia relativa de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis no cambió significativamente en HS, NI y LA.

Para determinar las características de C. acnes cultivable, se aislaron colonias bacterianas de la piel del mismo sitio en controles sanos (N10) y pacientes con acné (N10). Los resultados de WGS de los aislados de C. acnes se informan en la Tabla 2. Las 20 cepas se distribuyeron en cinco complejos clonales (CC), siendo el más frecuente CC1 (n = 9; 45,0%), seguido de CC3 (n = 5; 25%) y CC4, CC5 y CC6 (n = 2; 10% cada uno). La distribución general de CC mostró una diferencia significativa entre HS y LA (P = 0,03). El filotipo de C. acnes más representado fue el IA1 (n = 16; 80 %), seguido del tipo IB (n = 2; 10 %) y II (n = 2; 10 %). El análisis de filotipos reveló una diferencia significativa en la distribución entre HS y LA (P = 0,03), siendo el IA1 significativamente más abundante en LA que en HS (P = 0,03).

El número de supuestas secuencias de codificación de proteínas en diferentes genomas varió entre 2332 y 2427, con un promedio de 2380. Para evaluar la conservación genómica en los aislamientos de C. acnes, las secuencias de codificación se usaron para determinar el pan-genoma. Este análisis reveló un total de 2769 genes que representan el pan-genoma de 20 cepas de C. acnes. Para investigar los determinantes genéticos que diferencian entre diferentes aislados de C. acnes, se identificaron genes únicos consultando el conjunto de genes específicos del grupo. Específicamente, 305 genes ocurrieron únicamente en cepas de C. acnes aisladas de HS, mientras que se identificaron 104 genes únicos en C. acnes aisladas de LA (Fig. 3a).

Genes compartidos y únicos en 20 cepas de C. acnes. Los diagramas de Venn muestran la distribución de genes únicos y compartidos entre (a) cepas de C. acnes de sujetos sanos (HS) y el área lesionada de pacientes con acné (LA) y (b) filotipos IA1 e IB/II. Las regiones superpuestas muestran los genes conservados dentro de las cepas. El número entre paréntesis representa los genes únicos presentes en todas las cepas de un grupo en particular. (c) El gráfico de barras apiladas de las proporciones de las categorías funcionales del grupo de genes ortólogos (COG) se basa en los genes únicos de todos los grupos. La n encima de cada grupo indica el recuento absoluto de COG identificados en cada grupo. ( d ) Las categorías de matriz de similitud representan la presencia (azul; +) o la ausencia (rojo, -) de genes de virulencia de C. acnes y genes específicos de filotipo.

Sin embargo, no hubo genes únicos presentes en todas las cepas aisladas de diferentes sitios de la piel.

Se identificaron los genes únicos y centrales dentro de los filotipos para investigar más a fondo la posible agrupación en aislados de C. acnes (Fig. 3b). El análisis genético reveló que el filotipo IA1 contenía un mayor número de genes únicos (2559) que el IB/II (2532). Los análisis de genes únicos mostraron que 237 genes ocurrieron únicamente en el filotipo IA1, mientras que 210 caracterizaron al grupo IB/II (Fig. 3b). De los 237 genes únicos, 25 estaban presentes en todas las cepas tipo IA1 y 21 en las cepas IB/II, lo que representa el contenido genético clave que distingue las cepas tipo IA1 de los clados IB/II (Fig. 3b). Las categorías funcionales se analizaron e informaron en la Fig. 3c. En particular, de los 237 genes únicos presentes en IA1, el 43,9 % se asignó a funciones específicas, mientras que el 56,1 % permaneció con funciones desconocidas. De manera similar, en IB / II, el 44,3% de los 210 genes únicos se asignaron a funciones particulares y el 55,7% tenía funciones desconocidas (Fig. 3c). Curiosamente, para el filotipo IA1, se identificaron cinco genes únicos con funciones conocidas (acsA, clpS, dppB, rcsB, ytpA). En particular, AcsA y RcsB participan positivamente en la formación de biopelículas en diferentes especies bacterianas. ClpS es un producto génico esencial involucrado en un mecanismo altamente conservado que se dirige a proteínas específicas para su destrucción en procariotas y eucariotas; DppB es un transportador de dipéptido ABC requerido para el crecimiento bacteriano, y la lisofosfolipasa YtpA es un factor de virulencia en C. acnes que contribuye a la degradación e inflamación del tejido del huésped. Los clados tipo IB/II solo mostraron un gen único con una función conocida compartida en todas las cepas, la Shikimate quinasa gntK. Genes putativos del factor de virulencia, que codifican la proteína de adquisición de hierro (HtaA), las proteínas de choque térmico (DnaK, DnaJ y GroEL), el gen luxS, que está implicado en la síntesis del autoinductor 2, la oxigenasa radical RoxP y el Christie Los factores 1, CAMP 2 y CAMP 4 de Atkins-Munch-Petersen (CAMP) fueron omnipresentes en todas las cepas de C. acnes y no se asociaron con genotipos específicos (Fig. 3d). La actividad cohemolítica del factor CAMP se confirmó adicionalmente en placas de agar sangre para todos los aislados de C. acnes. Para descifrar aún más la relación entre las cepas del filotipo IA1, generamos un árbol filogenómico basado en la alineación de las variantes del genoma central y un árbol filogenético basado en las variaciones alélicas del pangenoma central (información complementaria). Los árboles mostraron las muestras agrupadas por complejo clonal y tipificación de secuencia, pero no por el sitio de la piel (HS frente a LA).

Las biopelículas de Cutibacterium acnes se observan con frecuencia en pacientes con acné47. Además, el análisis de agrupamiento jerárquico indicó que los genes relacionados con el biofilm AcsA y RcsB estaban presentes en los aislamientos IA1 pero no en IB/II, lo que sugiere posibles diferencias en la producción de biofilm. Por lo tanto, se investigó la capacidad de formación de biopelículas de diferentes aislados de C. acnes. En primer lugar, se midió la cinética de adhesión bacteriana temprana a las 0, 1, 3, 5, 7 y 24 h. No se observaron diferencias significativas en la formación temprana de biopelículas de las cepas de C. acnes de HS y LA durante todos los períodos analizados (Fig. 4a). Además, dado que IA1 colonizó tanto HS como LA, se analizó la cinética de la formación temprana de biopelículas en los grupos de filotipos. En particular, las cepas de C. acnes pertenecientes a los filotipos IA1 fueron significativamente más rápidas en la formación temprana de biopelículas que los filotipos IB/II, después de 1 (P = 0,0016), 3 (P = 0,0004), 5 (P < 0,0001) y 7 (P < 0,0001) horas. Sin embargo, a las 24 h, todas las cepas analizadas lograron una inhibición comparable de las micropartículas magnéticas independientemente del filotipo.

Formación de biopelículas de cepas de C. acnes. a Se midió la cinética de la adhesión bacteriana utilizando el BioFilm Ring Test para cepas de C. acnes aisladas de sujetos sanos (HS) y la piel lesionada de pacientes con acné (LA) y (b) según los filotipos IA1, IB, II. Se usó C. acnes ATCC 1182 como cepa de control de referencia. Se muestran la media y los errores estándar correspondientes para tres experimentos independientes de muestras duplicadas para cada punto de tiempo. ( c, d ) La cantidad de biomasa de biopelícula después de 72 h se midió mediante los ensayos de cristal violeta (densidad óptica (OD) a 595 nm). Se muestran la media y los errores estándar correspondientes para tres experimentos independientes de muestras duplicadas para cada punto de tiempo. ( e ) Imagen de microscopía confocal de la formación de biopelículas de diferentes aislados de C. acnes y C. acnes ATCC 1182 después de 72 h de incubación en BHI a 37 ° C. La significancia se evaluó utilizando la prueba estática de Kruskal Wallis. *, P < 0,05; **, p < 0,01; ***, P < 0,001, ****, P < 0,0001.

La formación de biopelículas se cuantificó aún más mediante la determinación de la biomasa con cristal violeta (CV) 72 h después de la incubación (Fig. 4b). Las cepas aisladas de LA produjeron un nivel de biomasa comparable a las de HS y C. acnes 11827 ATCC (Fig. 4c, d). En particular, los aislamientos IA1 formaron significativamente (P = 0,0004) más biopelícula que las cepas IB/II, lo que sugiere que el filotipo afectó la producción de biomasa en lugar del sitio de aislamiento (Fig. 4d).

La morfología de las biopelículas también se investigó mediante microscopía confocal (Fig. 4e) para las cepas de referencia C. acnes 11827 ATCC y los filotipos IA1, IB y II. La mayoría de los aislamientos de C. acnes produjeron una biopelícula espesa después de 72 h, como lo indica la presencia de agregados celulares y pilares de más de 20 µm (proyección z). De acuerdo con los resultados obtenidos por las pruebas de placa de microtitulación, los aislamientos IA1 exhibieron una mayor biomasa y espesor en comparación con los aislamientos IB y II.

La matriz del biofilm de C. acnes está compuesta por carbohidratos, proteínas y eDNA48. El impacto de la DNasa I y la proteinasa K en las biopelículas se ha utilizado para investigar la contribución del eDNA y las proteínas en la adhesión temprana y la formación de biopelículas49. El tratamiento con DNasa I y proteinasa K provocó una reducción sustancial en la unión inicial a las superficies abióticas de las cepas de C. acnes de todos los filotipos (Fig. 5). Sin embargo, el tratamiento con DNasa I mostró una reducción significativa (P < 0,001) en comparación con la proteinasa K en la unión inicial de las cepas de C. acnes, lo que sugiere que el eDNA es fundamental para la adhesión inicial. En particular, la reducción en la unión inicial a superficies abióticas de C. acnes es significativamente más pronunciada en los filotipos IB/II en comparación con IA1 (Fig. 5).

La ADNasa I y la Proteinasa K reducen la adhesión de C. acnes. Comparación de ADN y proteínas extracelulares en la adhesión superficial temprana para los filotipos IA1 e IB/II. Los resultados se expresan como diferencias relativas (Ec. 1) en las cantidades de biopelícula medidas mediante la prueba del anillo de biopelícula después de 6 h de incubación en presencia de DNasa y proteinasa K en comparación con las cepas de control no tratadas. Los datos representan las medias y los errores estándar correspondientes de dos experimentos independientes analizados por duplicado; *, P < 0,05; **, p < 0,01; ***, P < 0,001, ****, P < 0,0001 utilizando la prueba de Mann-Whitney.

Se midió la actividad de diferentes antibióticos por la concentración inhibitoria mínima (MIC) y la concentración mínima de erradicación de biopelícula (MBEC) en el crecimiento planctónico y de biopelícula en las diez cepas de C. acnes filotipo IA1 aisladas de LA. Los valores de MIC para cada antibiótico se resumen en la Fig. 6. Los perfiles de susceptibilidad aparentemente contradecían la falta de respuesta a varios anti-C. agentes acnes durante el tratamiento del acné44. Dado que todas las cepas eran productoras sustanciales de biopelículas, a continuación evaluamos la posible correlación con el aumento de la tolerancia a los antibióticos. Para ello, se evaluaron los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana en aislados microbianos que crecen en biopelículas.

Tolerancia antimicrobiana en aislamientos de C. acnes. (a) Prueba de susceptibilidad antimicrobiana contra diez cepas de C. acnes (filotipo IA1) aisladas de la piel lesionada de pacientes con acné en crecimiento planctónico y de biopelícula medido como concentración inhibitoria mínima (MIC) y concentración mínima de erradicación de biopelícula (MBEC) para los antibióticos indicados. (b) Mapa de calor que muestra la tolerancia del biofilm (BT), calculada como la relación MBEC/MIC para ampicilina, bencilpenicilina, clindamicina y doxiciclina. El amarillo indica valores altos de BT y el azul representa valores bajos de BT para los antibióticos indicados. Las diferencias estadísticas se determinaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba post hoc de Dunn para comparaciones múltiples.

Los carbapenémicos, la amoxicilina/ácido clavulánico, la piperacilina/tazobactam y la vancomicina fueron los antibióticos más efectivos contra las biopelículas de C. acnes con un MBEC comparable a los valores de CIM. Sin embargo, C. acnes que crece en biopelícula mostró un aumento significativo en la tolerancia a la ampicilina (P = 0,003), la bencilpenicilina (P < 0,001), la clindamicina (P < 0,001) y la doxiciclina (P < 0,001). Por lo tanto, la relación MBEC/MIC, que indica el aumento de veces en la dosis antimicrobiana necesaria para inhibir o eliminar las células de C. acnes en biopelículas en comparación con el crecimiento planctónico, se utilizó para cuantificar la puntuación de tolerancia de biopelícula (BT) (Fig. 6b). Los valores máximos de BT informados para la clindamicina fueron 32,1 y 17,6, y la mediana de los valores de BT para los antimicrobianos probados estuvo entre 2 (bencilpenicilina) y 4 (clindamicina y doxiciclina).

Cutibacterium es uno de los géneros más abundantes en la piel, particularmente en las zonas sebáceas50, y su proliferación se ha asociado en gran medida con el acné51,52. Aunque, el papel específico en la fisiopatología del acné vulgar sigue siendo incierto. Para dar cuenta de la complejidad del entorno microbiano de la piel, analizamos la microbiota en diferentes distritos de la piel de pacientes sanos y con acné. Nuestro estudio demostró diferencias estadísticamente significativas en la diversidad alfa y beta entre la piel de los sujetos sanos y las lesiones inflamatorias de los pacientes con acné. Específicamente, la diversidad alfa media se redujo significativamente en LA en comparación con HS. Estos datos sugieren que las condiciones anaeróbicas y ricas en lípidos dentro de la unidad pilosebácea de las lesiones inflamatorias del acné pueden proporcionar un microambiente óptimo para el crecimiento de C. acnes, lo que limita los competidores potenciales53,54. Estudios metagenómicos previos revelaron que las abundancias relativas de C. acnes no difieren significativamente entre sujetos con acné y sujetos sanos55,56,57. Sin embargo, la diferencia en la distribución de C. acnes podría atribuirse a varias variables, incluidos los procedimientos de secuenciación y los métodos de muestreo56. La estrategia de secuenciación y la selección de cebadores para el análisis del gen 16S rRNA son factores críticos para caracterizar las composiciones de las comunidades cutáneas bacterianas58. Por ejemplo, las regiones V1–V3 del gen 16S RNA tenían mayor precisión que la región V4 para definir la clasificación a nivel de género y especie de las principales bacterias de la piel59. En particular, la secuenciación V4 resultó en una evaluación imprecisa de las bacterias de la piel prominentes que mostraban abundancias relativas más bajas de S. epidermidis y C. acnes y una abundancia relativa más alta de S. aureus en comparación con la secuenciación V1–V359. Con base en estos datos, seleccionamos la región V1-V3, que nos permitió recuperar de manera efectiva las especies de Cutibacterium y Staphylococcus, definiendo perfiles imparciales de la comunidad microbiana de la piel e identificando posibles biomarcadores microbianos asociados con el acné. El sitio y la técnica de muestreo también pueden afectar el resultado del análisis basado en secuenciación del microbioma de la piel60. Estudios anteriores informaron que un hisopo es una técnica confiable para analizar el microbioma de la piel comparable al método de pelado con cinta61,62. En nuestro estudio, las muestras de microbioma se recolectaron mediante la técnica de hisopado directamente en los sitios de LA y NI para cada paciente y se compararon con la misma área de HS, lo que proporcionó una caracterización limitada de la población microbiana local. La posibilidad de recolectar muestras de microbioma de la piel lesionada puede haber arrojado resultados más específicos en comparación con otros estudios que aplicaron diferentes técnicas de muestreo. De hecho, otros recolectaron muestras de microcomedones nasales de pacientes con acné utilizando tiras adhesivas. Esta técnica de muestreo es ideal para identificar una población microbiana homogénea; sin embargo, puede que no refleje específicamente la distribución microbiana presente en los diferentes microambientes del acné55. En nuestro estudio, el género Cutabacterium fue más abundante en LA y NI en comparación con HS. En consecuencia, se observó un aumento significativo de C. acnes en LA en comparación con NI y HS. Estos resultados sugieren que, aunque es muy prevalente en la piel de HS y pacientes con acné, la abundancia relativa de C. acnes aumenta significativamente en LA inflamada en comparación con NI. Por lo tanto, el sobrecrecimiento de C. acnes en AL puede explicar potencialmente la prevalencia de la enfermedad en una parte de la población, a pesar de la portación universal del microorganismo. Estas observaciones respaldan hallazgos previos que sugieren que la obstrucción de la unidad pilosebácea y el aumento de la proliferación de C. acnes son probablemente factores centrales en la aparición de lesiones inflamatorias del acné63,64. Esto es consistente con el aumento de C. acnes que se encuentra en el acné, lo que, a su vez, se correlaciona con los brotes de acné en adolescentes, con altos niveles de hormonas y producción de sebo65. De hecho, los adolescentes con acné tienen recuentos de C. acnes significativamente más altos que los controles de la misma edad, lo que demuestra un marcado aumento de este microorganismo, que promueve la inflamación a través de varios mecanismos64,66,67. Factores específicos del huésped, como la producción de sebo, el nivel hormonal, el medio inflamatorio y los cambios físicos en la unidad pilosebácea, pueden contribuir a la patogénesis del acné, lo que indica que ciertas cepas pueden volverse patógenas en diferentes condiciones o bajo estímulos ambientales específicos16. Se ha sugerido que el acné inflamatorio resulta de un desequilibrio en la microbiota de la piel asociada con filotipos específicos de C. acnes35,68. Nuestro estudio encontró que los complejos clonales CC1 y CC3 eran más abundantes en LA que en HS; en cambio, CC4, CC5 y CC6 estaban presentes solo en HS. Además, IA1 estuvo significativamente más representado en LA que en HS, y los filotipos IB y II se encontraron solo en la piel de HS. Los datos de este estudio son consistentes con informes previos que revelan que las lesiones graves de acné inflamatorio tanto en la cara como en la espalda están asociadas con la pérdida de diversidad en los filotipos de C. acnes, con un alto predominio del filotipo IA1 en comparación con los controles sanos38,69,70. Fitz-Gibbon et al., analizaron la distribución de los ribotipos de C. acnes (RT1, RT2, RT3) entre los folículos con acné y normales55, e informaron que CC3 y CC4 del filotipo IA1 estaban significativamente enriquecidos en pacientes con acné, pero rara vez se encuentran en individuos con piel sana. Por el contrario, RT6, que representa una subpoblación del filotipo II, se asoció en un 99 % con una piel sana. Curiosamente, los IB no asociados con el acné, los tipos II y III, también se recuperan comúnmente de infecciones de tejidos profundos y se recuperan de dispositivos médicos16. La pérdida de diversidad entre los seis filotipos, caracterizada por un predominio de la proliferación de IA1 en lugar de C. acnes, puede desempeñar un papel clave en el desencadenamiento del acné69,70,71,72,73. Como C. acnes es el principal colonizador de la piel, el análisis del nivel de tensión es importante para ayudar a comprender el papel de esta bacteria en la patogénesis del acné y la salud de la piel. La secuenciación completa del genoma de diferentes cepas de fuentes ambientales variables, como el acné vulgar y la infección asociada a implantes, ha revelado el pangenoma y el repertorio genético de C. acnes31,74,75,76. Además, los análisis metagenómicos mostraron que varios elementos genéticos distintos asociados con la virulencia que codifican péptidos antimicrobianos, citotoxinas y proteasas se enriquecieron en las cepas de C. acnes asociadas con el acné12. El genoma accesorio de C. acnes es relativamente pequeño, y los genes secundarios frecuentemente codifican una variedad de funciones específicas del filotipo31,74,75. La variabilidad a nivel de filotipo puede correlacionarse con el fenotipo comensal o patógeno de C. acnes y su contribución al acné69. En nuestro estudio, los análisis WGS mostraron que los factores CAMP se detectaron en todas las cepas. Además, de acuerdo con observaciones previas, informamos que los principales determinantes de virulencia están muy extendidos entre C. acnes y no están asociados específicamente con ningún sitio de aislamiento o el filotipo77. Asimismo, observamos que luxS y roxP, esenciales para la adherencia y colonización de la piel, eran ubicuos en todas las cepas de C. acnes y no se asociaban a genotipos específicos. La alta distribución de genes de virulencia entre aislados de C. acnes se describió previamente, lo que sugiere que la regulación de la transcripción puede ser crítica en la expresión de virulencia diferencial entre filotipos78,79,80. Sin embargo, el análisis de grupos funcionales mostró que el filotipo IA1 se caracterizó por un número reducido de genes del metabolismo de carbohidratos y transportadores de azúcar en comparación con los filotipos IB/II. Estos datos sugieren que el transporte y el metabolismo de los carbohidratos pueden conferir a C. acnes una ventaja ecológica en la piel sana, pero no son estrictamente necesarios para la colonización selectiva de las lesiones inflamatorias del acné. De hecho, estudios previos plantearon la hipótesis de una conexión entre los niveles altos de sebo y la colonización por C. acnes en pacientes con acné81. En consecuencia, observamos que los genes de transporte y metabolismo de lípidos están aumentados en las cepas del filotipo IA1, en comparación con los filotipos IB/II, independientemente del sitio de aislamiento. De hecho, es poco probable que las cepas de filotipo IA1 aisladas de LA tengan, per se, propiedades diferentes que las mismas cepas de filotipo de piel sana. De acuerdo con publicaciones anteriores, no encontramos diferencias en los genomas y la producción de biopelículas de cepas de filotipo IA1 aisladas de acné y piel sana82. Se requieren estudios futuros para definir cómo se expresan los genes de virulencia en diferentes filotipos. El análisis de imágenes anterior mostró que la estructura de los microcomedones en pacientes con acné se asemeja a una bolsa que contiene lípidos con grupos de bacterias, cuya cubierta exterior comprende capas de corneocitos83. La extensa colonización de bacterias es visible usando TEM83. El metabolismo de C. acnes modifica la composición lipídica de la piel y las lipasas bacterianas liberan ácidos grasos libres de los triglicéridos. Los ácidos grasos libres al ser más viscosos que los triglicéridos, pueden obstruir la unidad pilosebácea, que a su vez se vuelve anaeróbica, promoviendo la proliferación selectiva del filotipo IA1 que aprovecha mejor los microambientes ricos en lípidos de la unidad pilosebácea durante el acné en comparación con otros filotipos83,84,85 . Los análisis de los genes únicos presentes en diferentes filotipos nos permitieron identificar que de 2769 genes, cinco genes con funciones conocidas estaban unívocamente presentes en todos los aislamientos IA1 (acsA, clpS, dppB, rcsB e ytpA). En particular, el gen ytpA, que codifica una lisofosfolipasa que contribuye a la degradación e inflamación del tejido del huésped, estaba presente en todos los aislamientos de IA1.

Para superar estas dificultades, se necesita una mejor comprensión del potencial patógeno de las subpoblaciones individuales. Además, otros especularon que la naturaleza persistente del acné vulgar está relacionada con la colonización de la unidad pilosebácea en una biopelícula por parte de C. acnes, eludiendo así la erradicación de los antibióticos40,86. Esta teoría se apoyó al observar que el genoma de los aislados IA1 contiene genes como rcsB, acsA que tienen un papel positivo en la formación de biopelículas en otras especies bacterianas41,87,88,89. Específicamente, el análisis transcriptómico de Helicobacter pylori reveló que varios genes del metabolismo de la acetona, incluido acsA, están regulados al alza en las células del biofilm89. La vía de fosforescencia de RcsCDB coordina las expresiones de un gran número de genes esenciales para mantener la integridad de la pared celular, la división celular, la actividad del factor sigma de fase estacionaria, el desarrollo de biopelículas, la motilidad y la virulencia en Enterobacteriaceae90,91. RcsB regula hacia arriba los genes que promueven la formación de biopelículas mientras regula a la baja diferentes funciones metabólicas en Escherichia coli87,88. El análisis comparativo de la formación de biopelículas in vitro mostró que el filotipo IA1 fue significativamente más rápido en la formación temprana de biopelículas que las cepas IB y II en la inhibición de las micropartículas magnéticas.

Además, la cuantificación de biopelículas mostró que las cepas IA1 produjeron biopelículas significativamente más maduras que los otros filotipos, lo que confirma que tanto el ADN como las proteínas son necesarios para la adhesión temprana y la formación de biopelículas en C. acnes39. Además, nuestros hallazgos sugieren que, independientemente del sitio de aislamiento, todas las cepas producen biopelícula; sin embargo, el filotipo IA1, que es el más prevalente en AP, resultó ser el más eficaz. Esta noción se ve reforzada indirectamente por los resultados de la microscopía confocal, que muestran claramente el desarrollo de una matriz de biopelícula gruesa y estructuralmente compleja en el filotipo IA1. Además, los ensayos de sensibilidad a la DNasa I y la Proteinasa K revelaron que el eDNA y las proteínas son fundamentales para la adhesión superficial temprana a superficies abióticas, y el eDNA desempeña un papel importante. Además, se pudo observar un aumento de la sensibilidad a la DNasa I de los filotipos IB/II. Por lo tanto, en pacientes con acné, un microambiente hiperseborreico, caracterizado por una alta disponibilidad de sebo, puede resultar en una mayor proporción de cepas productoras de biopelículas metabólicamente activas, proporcionando una ventaja selectiva a un subconjunto de filotipos o subtipos asociados con el acné, contribuyendo así al medio proinflamatorio de las lesiones de acné54,65.

Aunque los antibióticos pueden reducir o eliminar C. acnes, la recolonización ocurre con frecuencia en unas pocas semanas, con una eficacia clínica limitada44. La alta tolerancia de C. acnes a los tratamientos antimicrobianos no depende de la expresión de genes multirresistentes ya que, en general, C. acnes es susceptible a la mayoría de los antimicrobianos44,92. Por el contrario, la capacidad de C. acnes de persistencia crónica y recaída después de la terapia con antibióticos es fuertemente sugestiva de colonización relacionada con biopelículas9,93. Estos hallazgos se alinean con nuestros resultados que muestran que todos los aislamientos de C. acnes fueron altamente susceptibles a la mayoría de los antibióticos, con valores de MIC muy por debajo de los puntos de corte clínicos. Sin embargo, el perfil de susceptibilidad de las cepas de C. acnes que desarrollan biopelículas indicó un aumento significativo en la tolerancia antimicrobiana frente a la ampicilina, la bencilpenicilina, la clindamicina y la doxiciclina. Para el tratamiento sistémico, las tetraciclinas orales (doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina o tetraciclina) son los antibióticos más recomendados para el tratamiento del acné severo, seguidas de la clindamicina por efectos adversos relevantes9; mientras que los tratamientos con antibióticos tópicos se basan principalmente en clindamicina, eritromicina y tetraciclina9. Estas observaciones pueden explicar la alta tolerancia de C. acnes al tratamiento antimicrobiano y la evidencia contradictoria sobre el beneficio clínico del uso de anti-C. acnes, incluso en los casos en que la terapia se basó en los resultados de MIC44. Además, encontramos que la vancomicina, la piperacilina/tazobactam y la amoxicilina/ácido clavulánico podrían erradicar eficazmente las biopelículas maduras de C. acnes, con BMIC similar a MIC. El antibiótico más común y efectivo contra C. acnes en pacientes con endocarditis de válvula protésica fue la vancomicina94,95. Además, encontramos que los aislados de C. acnes eran altamente susceptibles a los carbapenémicos tanto en estado planctónico como de biopelícula. Investigaciones previas demostraron que los carbapenémicos eran muy activos in vitro e in vivo frente a cepas de C. acnes aisladas de endoftalmitis posquirúrgica96.

Nuestro estudio adolece de algunas limitaciones. De hecho, el presente análisis se realizó en un pequeño grupo de pacientes. Además, la condición in vitro para la prueba de biopelícula puede no ser completamente representativa de las condiciones reales in vivo de la unidad pilosebácea de pacientes con acné. Además, solo se seleccionó un aislado de C. acnes de cada paciente. Es posible que este procedimiento no haya capturado toda la diversidad de filotipos de C. acnes en la región facial. Sin embargo, una publicación reciente demuestra que las colonias de C. acnes de la piel de sujetos adultos sin acné vulgar suelen estar muy estrechamente relacionadas, lo que sugiere la presencia de poblaciones específicas de personas97. Por lo tanto, se requerirá más investigación para dilucidar si estas observaciones pueden transferirse in vivo, y cualquier hallazgo clínico debe interpretarse con precaución.

En general, los resultados presentados en este estudio indican que las lesiones inflamatorias de los pacientes con acné se caracterizan por disbiosis y disminución de la diversidad bacteriana. A nivel de especie, C. acnes es significativamente más abundante en LA que en NI y HS. Las diferencias genotípicas y fenotípicas significativas entre los aislamientos de C. acnes fueron dictadas principalmente por el filotipo más que por el sitio anatómico del aislamiento. En particular, los aislamientos IA1 fueron más eficientes en la adhesión temprana, la producción de biomasa y la tolerancia a los antibióticos que otros filotipos. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que en el acné adolescente, los cambios bioquímicos y físicos de la unidad pilosebácea pueden promover la disbiosis, proporcionando así una ventaja selectiva a un subconjunto de filotipos productores de biopelículas metabólicamente activas, como IA1, que tienen el potencial y la virulencia, para superar a los comensales que exacerban la respuesta inflamatoria98. En consecuencia, la patogenia del acné adolescente puede no ser causada por la mera presencia de un filotipo asociado a la enfermedad, sino más bien por la respuesta de la comunidad microbiana general a los cambios microambientales de la unidad pilosebácea. Quedan por dilucidar los factores que contribuyen al crecimiento de C. acnes en comparación con los competidores durante la progresión de las lesiones de acné no inflamadas a las inflamadas. Sin embargo, los nuevos agentes antimicrobianos dirigidos a los componentes de la matriz del biofilm de C. acnes pueden representar tratamientos potenciales para modular la microbiota de la piel en el acné adolescente.

Los pacientes con lesiones graves de acné fueron reclutados entre los sujetos en su primer acceso a la Unidad de Acné del Instituto Dermatológico San Gallicano. El grupo control se inscribió entre los HS sometidos a controles de lunares en la misma Institución. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes y de su representante legal. Dos dermatólogos evaluaron las puntuaciones de gravedad del acné y la clasificación clínica. La intensidad de las manifestaciones clínicas se evaluó en las áreas de la cara de acuerdo con los criterios de gravedad del acné global europeo (GEAS)99. Brevemente, los sujetos se clasificaron como no afectados (claros) cuando ninguna o muy pocas lesiones eran clínicamente observables (0 ≤ GEAS < 1). Las puntuaciones GEA entre 1 y 2 se denominaron grupo leve, las puntuaciones GEA 3 como grupo moderado y los pacientes con GEAS 4-5 se clasificaron como grupos graves. Se pidió a los participantes que mantuvieran sus rutinas de cuidado de la piel excepto la prohibición del uso de cosméticos y productos hidratantes para el cuidado de la piel el día de la inscripción. Los criterios de inclusión fueron la ausencia de enfermedades sistémicas y trastornos de la piel distintos del acné. Los criterios de exclusión fueron tratamientos farmacológicos orales o tópicos en la primera visita o hasta 2 semanas antes de la exploración, tabaquismo y uso de hamacas. El estudio se realizó de acuerdo con la declaración de Helsinki y todos los pacientes incluidos firmaron un consentimiento informado. El Comité Central de Ética IRCCS Lazio, la sección del Istituti Fisioterapici Ospitalieri en Roma, aprobó este estudio (Protocolo 7679—21.06.2016, número de registro de ensayos 821/16).

Las muestras fueron recolectadas por dermatólogos con hisopos estériles disponibles comercialmente (hisopos COPAN, Brescia, Italia) de la piel de 10 HS y la piel no afectada y pústula de 10 pacientes con acné por duplicado para evaluar la presencia de C. acnes y para el análisis de microbioma. Los hisopos fueron llevados al Laboratorio de Microbiología y Virología del Instituto San Gallicano para análisis de cultivo y procesados ​​inmediatamente en atmósfera anaeróbica. Se utilizaron placas de agar Schaedler con sangre de carnero al 5 % (bioMérieux) para aislar y cultivar C. acnes. Se controló el crecimiento bacteriano de las placas después de 5 a 7 días de incubación anaeróbica a 37 °C. Se identificaron preliminarmente hasta siete colonias representativas de C. acnes mediante la morfología de la colonia y la tinción de Gram. La identificación adicional de aislados de C. acnes se realizó mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Los aislados positivos se subcultivaron en placas de agar Schaedler para obtener un cultivo puro de C. acnes. De cada cultivo, se obtuvo ADN bacteriano y se utilizó el análisis de secuencia (ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer) del gen 16SrRNA para confirmar la identificación bacteriana100. Al mismo tiempo, se identificó preliminarmente el filotipo mediante Touch-down PCR101. El filotipo más común de cada muestra (detectado en el 85-100% de las colonias) se consideró el tipo dominante. Se seleccionó un único aislado representativo de cada filotipo dominante para su posterior análisis. Los aislados de C. acnes se congelaron y almacenaron a -80 °C. La reacción cohemolítica del factor CAMP en placas de agar sangre (bioMérieux) se realizó utilizando la cepa de S. aureus ATCC 25923, según el método anterior23.

El ADN extraído se amplificó mediante PCR con cebadores de doble índice dirigidos a las regiones V1-V3 del gen bacteriano 16S rRNA, utilizando el kit ARROW for NGS Microbiota solution A (ARROW Diagnostics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el control de calidad se utilizó un tubo de muestra estéril que se había sometido a los mismos procedimientos de extracción de ADN y amplificación por PCR102. Antes de la secuenciación, los amplicones se purificaron con el sistema de purificación por PCR Agencourt® AMPure XP (Beckman Coulter, Milán, Italia), y se combinaron y diluyeron cantidades iguales (10 nM) del ADN de la muestra para alcanzar una concentración de 4 nM. Finalmente, se usó una muestra desnaturalizada de 5 pM para generar secuencias usando el kit de reactivos MiSeq de 2 × 250 ciclos (Illumina) en un instrumento Illumina MiSeq. Los datos de secuenciación se analizaron utilizando el sistema MicrobAT102,103. Durante el procesamiento de MicrobAT, se descartaron las secuencias demultiplexadas que mostraban lecturas de una longitud inferior a 200 nucleótidos, una puntuación de calidad media de Phred inferior a 25 y al menos una base ambigua104. Las secuencias resultantes se alinearon con una similitud de secuencia del 97 % y se asignaron a niveles taxonómicos (p. ej., especie) con un umbral de clasificación del 80 % utilizando el clasificador Ribosomal Database Project (RDP) (versión 11.5)105. Las especies que no cumplieron con estos criterios se asignaron al grupo correspondiente, "[género] sin clasificar". Se obtuvo la Matriz de Observación Biológica (BIOM) y se realizó el siguiente análisis en R studio (https://www.rstudio.com/; versión 4.0.2) utilizando el paquete phyloseq106. Las diferencias de la comunidad microbiana se midieron en términos de diversidad alfa y beta después de leer la profundidad de rarefacción. Se utilizaron el índice de Shannon y el índice de Pielou para evaluar la diversidad alfa, y la significación se evaluó mediante la prueba de Kruskal Wallis. Se calculó la diversidad beta de Bray Curtis y la matriz de distancia se representó como análisis de coordenadas principales (PCoA)107. La significancia se evaluó mediante el análisis de varianza multivariante permutacional (PERMANOVA)108. Se examinaron las abundancias relativas de bacterias a nivel de filo y género entre grupos seleccionados.

Los archivos FASTQ, incluidos el control de calidad, el recorte, el ensamblaje y la anotación de genes, se elaboraron utilizando la suite Bactopia109. El pan-genoma se obtuvo utilizando Roary110 en los ensamblajes anotados. La anotación funcional se realizó utilizando EggNOG v5.0111 en las secuencias de proteínas. Los filotipos y los complejos clonales se determinaron consultando la API de PubMLST (www.pubmlst.org) utilizando scripts de Python personalizados. El análisis del genoma completo de variantes (SNP/indels) en las cepas IA1 y el árbol filogenómico se obtuvo como se describió anteriormente112. El análisis independiente del núcleo del genoma se realizó utilizando PIRATE113 en las cepas IA1 para construir un árbol filogenómico.

La producción de biopelículas se evaluó mediante la prueba clínica BioFilm Ring Test (cBRT) con algunas modificaciones114. Brevemente, se usaron cultivos bacterianos durante la noche cultivados en placas de agar Schaedler + sangre de oveja al 5 % (bioMérieux, Francia) para inocular 2 ml de solución salina al 0,45 % (AirLife, Carefusion, CA, EE. UU.) al equivalente de 2,5 ± 0,3 estándar de turbidez de McFarland . La suspensión bacteriana se usó para inocular una placa de poliestireno de 96 pocillos con 200 μL/pocillo. La prueba se realizó con una solución de tóner (TON) (Biofilm Control, Saint Beauzire, Francia) que contenía perlas magnéticas al 1 % (v/v) mezcladas en medio Brain Heart Infusion (BHI, Difco, Detroit, MI, EE. UU.). Se realizaron diluciones de muestra (diluciones en serie de diez veces, de 1 × 10–1 a 1 × 10–3) en un volumen de 200 μL de mezcla BHI/TON. La cepa de laboratorio C. acnes ATCC 11827 se incluyó en cada prueba como estándar de referencia y control de calidad. En cada experimento se usó un pocillo que contenía la mezcla BHI/TON sin células microbianas como control negativo. Las placas se incubaron a 37 °C sin agitación (cultivo estático) en condiciones anaeróbicas. La formación de biopelículas se evaluó en diferentes momentos. Después de la incubación, los pocillos se cubrieron con unas gotas de líquido de contraste (se usó aceite opaco inerte), se colocaron durante 1 min en el bloque con 96 miniimanes (Block test) y se escanearon con un lector de placas diseñado específicamente (Pack BIOFILM, Biofilm Control , Saint Beauzire, Francia)115. Cada cepa se analizó por duplicado y los experimentos se repitieron tres veces.

Se utilizó el método Biofilm Ring Test para evaluar la adherencia temprana en presencia de DNasa I (100 μg/mL) y proteinasa K (50 μg/mL)49,116. Las suspensiones bacterianas estandarizadas que contenían 1 % en volumen de perlas magnéticas se complementaron con ADNasa (100 μg/ml) y proteinasa K (50 μg/ml) y se incubaron a 37 °C en una microplaca de 96 pocillos (200 μl/pocillo). Los controles negativos contenían 200 μL de BHI estéril con cuentas magnéticas y enzimas. La placa se leyó después de 6 h de incubación, como se describió anteriormente. La adhesión temprana en presencia de DNasa y proteinasa K se expresó mediante la diferencia relativa (RD):

El análisis se realizó tres veces por duplicado para cada muestra.

Se inocularon placas de poliestireno estériles de 96 pocillos con 200 μL de una suspensión bacteriana inicial (105 UFC/mL) en caldo BHI incubado a 37 °C durante 72 h en condiciones anaerobias sin agitación. Como se describió anteriormente, la formación de biopelículas se analizó mediante tinción con cristal violeta en placas de microtitulación de 96 pocillos114.

Las CIM se determinaron para cada cepa mediante el método de microdilución en caldo descrito anteriormente116 ​​y se adaptaron a las condiciones de crecimiento específicas de C. acnes. Específicamente, las cepas de C. acnes cultivadas en placas de agar Schaedler se inocularon en 2 ml de solución salina al 0,45 % (Air Life, Carefusion, CA, EE. UU.) para obtener una turbidez de 0,5 ± 0,1 estándar de turbidez de McFarland (aproximadamente 108 UFC/ml). Las muestras se diluyeron a 1:100 en BHI y se sembraron 100 μL de suspensión bacteriana en una placa de poliestireno estéril de 96 pocillos que contenía diferentes antibióticos en concentraciones variables (Corning Inc., Corning, NY, EE. UU.). Se prepararon diluciones seriadas al doble de amoxicilina/ácido clavulánico, ampicilina, bencilpenicilina, clindamicina, doxiciclina, ertapenem, imipenem, meropenem, moxifloxacina, piperacilina/tazobactam, tigeciclina, vancomicina. Después del tratamiento con antibióticos, se determinaron las células viables mediante recuento en placa para la determinación de UFC/mL. La MIC se definió como la concentración más baja de un antibiótico que previene el crecimiento bacteriano. Los experimentos fueron realizados por triplicado.

Para cada experimento, se usó un cultivo de C. acnes cultivado durante la noche en una placa de agar sangre para inocular 2 ml de solución salina al 0,45 % con un estándar de turbidez de 0,5 ± 0,1 de McFarland. Para los cultivos de biopelículas, se utilizaron suspensiones celulares diluidas (aproximadamente 106 CFU/ml) para inocular una placa de fondo plano de poliestireno de 96 pocillos con 100 ml de BHI. Después de 24 h a 37 °C, en condiciones anaerobias, los pocillos se enjuagaron con solución salina al 0,45 % para eliminar las bacterias no adherentes. La placa se lavó tres veces con agua destilada y las células adherentes se resuspendieron en 100 ml de BHI suplementado con diluciones seriadas dobles de amoxicilina/ácido clavulánico, ampicilina, bencilpenicilina, clindamicina, doxiciclina, ertapenem, imipenem, meropenem, moxifloxacino, piperacilina/tazobactam, tigeciclina, vancomicina. Después del tratamiento durante la noche, se eliminaron los antibióticos y la placa se lavó dos veces con 200 μL de agua destilada estéril. Las biopelículas se rasparon a fondo y el número total de células viables se determinó mediante dilución en serie y placas de agar Schaedler para estimar el número de CFU. El MBEC se definió como la concentración más baja de un agente antibiótico que previene el crecimiento bacteriano.

Se calcularon las relaciones MBEC/MIC para evaluar la puntuación de tolerancia del biofilm (BT), que indica el aumento de veces en la dosis antimicrobiana necesaria para inhibir o eliminar las células de C. acnes en el biofilm en comparación con el crecimiento planctónico116.

Se usaron colonias de Cutibacterium acnes, cultivadas durante la noche en placas de agar Schaedler, para inocular 3 ml de solución salina al 0,45 % (Air Life, Carefusion, CA, EE. ml. Las muestras se diluyeron 1:1000 y se resuspendieron en 1 ml de BHI en un portaobjetos de cámara con fondo de vidrio de 8 pocillos μ-Slide (Ibidi, Alemania). La suspensión bacteriana se incubó a 37 °C durante 72 h para permitir la formación de biopelículas. Posteriormente, se retiró el medio y las muestras se lavaron en una solución salina al 0,45%. Según las especificaciones del proveedor, las células del biofilm se tiñeron con el kit LIVE/DEAD BacLight (Life Technologies, Nueva York, NY, EE. UU.)116 y se examinaron con un microscopio de escaneo láser Zeiss LSM5 Pascal (Zeiss, Oberkochen, Alemania), versión de software 2.8 ( Zeiss).

Los datos se expresaron como la media ± error estándar de la media. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA con Tukey post-hoc o Kruskal-Wallis con pruebas post-hoc de Dunn, seguido de la corrección del valor de p adecuada. Para la diversidad Beta, se utilizó PERMANOVA en matrices de distancia Bray-Curtis. Los valores de P de 0,05 o menos se consideraron estadísticamente significativos. Se utilizó el software estadístico IBM SPSS v.21 (IBM, Chicago, IL, EE. UU.) para todos los análisis estadísticos.

Los autores declaran que los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento o del autor correspondiente a pedido razonable. Los datos de este estudio se han depositado en el Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) en EMBL-EBI con el número de acceso PRJEB55087 (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/ PRJEB55087).

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Descargar referencias

Microbiología y Virología, Instituto IRCCS San Gallicano, Roma, Italia

Ilaria Cavallo, Francesca Sívori, Martina Pontone y Fulvia Pimpinelli

Fisiopatología cutánea, Instituto Dermatológico San Gallicano, IRCCS, Roma, Italia

Mauro Truglio y Giorgia Cardinali

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Flavio De Maio y Maurizio Sanguinetti

Departamento de Biología y Biotecnología Charles Darwin, Universidad Sapienza de Roma, Roma, Italia

Federica Lucantoni, Fiorentina Ascenzioni y Enea Gino Di Domenico

Biofilm Pharma SAS, Saint-Beauzire, Francia

Thierry Bernardi

Departamento de Ciencias Biotecnológicas Básicas, Cuidados Intensivos y Clínicas Perioperatorias - Sección de Microbiología, Universidad Católica del Sagrado Corazón, Roma, Italia

maurizio sanguinetti

Dermatología Clínica, Instituto Dermatológico San Gallicano, IRCCS, Roma, Italia

Bruno Capitán y Antonio Christaudo

Dirección Científica, IRCCS Instituto San Gallicano, Roma, Italia

aldo morrone

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ED diseñó el estudio y escribió el artículo. MT, FD, MS, FP, TB, FA, AM y FP, discutieron los resultados y las implicaciones y escribieron el manuscrito. FS, IC, GC, FL, MP, BC y ED realizaron los experimentos. MT y FD llevó a cabo el análisis estadístico. BC, AM, AC y FP recopilaron, supervisaron e interpretaron los datos clínicos. Todos los autores analizaron los datos, revisaron críticamente el manuscrito y aprobaron la versión enviada.

Correspondencia a Enea Gino Di Domenico.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Cavallo, I., Sívori, F., Truglio, M. et al. Disbiosis cutánea y biopelícula de Cutibacterium acnes en lesiones inflamatorias de acné en adolescentes. Informe científico 12, 21104 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25436-3

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Recibido: 25 julio 2022

Aceptado: 29 de noviembre de 2022

Publicado: 06 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25436-3

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