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Nov 29, 2023

Derribo de ADAMTSL3

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1392 (2022) Citar este artículo

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La insuficiencia cardíaca es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo y puede deberse a una sobrecarga de presión, en la que la remodelación cardíaca se caracteriza por hipertrofia y muerte de los cardiomiocitos, fibrosis e inflamación. En los corazones que fallan, el factor de crecimiento transformante (TGF) β conduce a los fibroblastos cardíacos (CFB) a la diferenciación de miofibroblastos, lo que provoca una producción excesiva de matriz extracelular y una remodelación cardíaca. Se necesitan nuevas estrategias para apuntar a la señalización patológica de TGFβ en la insuficiencia cardíaca. Aquí mostramos que la glicoproteína secretada ADAMTSL3 regula el TGFβ en el corazón. Descubrimos que los ratones knock-out para Adamtsl3 desarrollan disfunción cardíaca exacerbada y dilatación con mayor mortalidad, y los corazones muestran una mayor actividad de TGFβ y activación de CFB después de la sobrecarga de presión por la banda aórtica. Además, la sobreexpresión de ADAMTSL3 en CFB cultivados inhibe la señalización de TGFβ, la diferenciación de miofibroblastos y la síntesis de colágeno, lo que sugiere un papel cardioprotector para ADAMTSL3 al regular la actividad de TGFβ y el fenotipo de CFB. Estos resultados justifican futuras investigaciones sobre los posibles efectos beneficiosos de ADAMTSL3 en la insuficiencia cardíaca.

La insuficiencia cardíaca es una de las principales causas de morbilidad, hospitalización y mortalidad en todo el mundo y afecta al 2-3% de la población1. Con la sobrecarga de presión, el miocardio se remodela con respuestas fisiopatológicas distintivas que incluyen hipertrofia y muerte de los cardiomiocitos, fibrosis e inflamación, con un crecimiento hipertrófico que a menudo precede a la insuficiencia cardíaca dilatada2.

La matriz extracelular (MEC) es crucial para mantener la integridad estructural y funcional cardíaca, y los fibroblastos cardíacos (CFB) son los principales productores de MEC en el corazón3. Durante la insuficiencia cardíaca, los CFB se activan y se transdiferencian en miofibroblastos altamente proliferantes y productores de ECM3,4, caracterizados por una expresión robusta de actina de músculo liso α (α-SMA)5,6. Este proceso es crítico en la cicatrización de heridas, sin embargo, la activación excesiva de CFB impulsa la remodelación cardíaca patológica a través de la activación del factor de crecimiento, la inflamación, la reducción de la conductancia eléctrica y el aumento de la rigidez del miocardio, como resultado del aumento de la deposición de colágeno y el entrecruzamiento en la fibrosis cardíaca3,7. El factor de crecimiento transformante (TGF) β es necesario para la activación de CFB5 y representa un objetivo terapéutico atractivo en la insuficiencia cardíaca8. Sin embargo, la inhibición directa de TGFβ está limitada por efectos fuera del objetivo9,10, y se necesita una mejor comprensión de la activación de CFB mediada por TGFβ en el corazón para mejorar los resultados de la insuficiencia cardíaca.

Las proteínas matricelulares son moléculas reguladoras no estructurales expresadas dinámicamente en el ECM7 cardíaco. Recientemente identificamos que una familia de siete miembros de proteínas matricelulares, el dominio a desintegrina y metaloproteasa con proteínas similares a motivos de trombospondina tipo 1 (ADAMTSL), está regulada positivamente en la insuficiencia cardíaca clínica y experimental11. Las ADAMTSL están estructuralmente relacionadas con las proteasas ECM de ADAMTS12, pero carecen de un dominio catalítico, por lo que su función biológica se desconoce en gran medida. La evidencia acumulada apunta a un papel en la regulación de TGFβ, ya que varias ADAMTSL se unen y regulan las microfibrillas de fibrilina y la proteína de unión a TGFβ latente (LTBP)1, que secuestran TGFβ en la ECM13,14. Las variantes en los genes ADAMTSL fenocopian fibrilinopatías, con señalización de TGFβ desregulada como una característica molecular constante11,15,16,17.

Aquí, informamos la generación y caracterización de un ratón con inactivación dirigida de Adamtsl3 (L3-KO), que usamos para investigar ADAMTSL3 en el corazón sobrecargado de presión. Descubrimos que los ratones L3-KO desarrollan disfunción y dilatación cardíaca, con una mayor mortalidad y una mayor actividad de TGFβ y activación de CFB después de la sobrecarga de presión inducida por bandas aórticas (AB). La sobreexpresión de ADAMTSL3 en CFB humanos cultivados inhibió la actividad de TGFβ y la conversión de miofibroblastos, lo que resultó en una reducción de la expresión de ECM y la síntesis de colágeno.

La expresión de ADAMTSL3 aumentó 2 veces en los LV de pacientes con estenosis aórtica (AS; Fig. 1a), y en el miocardio de pacientes con MCD isquémica (iDCM), el ARNm y la proteína de ADAMTSL3 aumentaron 1,5 veces (Fig. 1b-c). ). Las características de los pacientes se informaron previamente, con pacientes que tenían EA sintomática con hipertrofia del VI, fibrosis e insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (HFpEF)18, o MCD en etapa terminal con fibrosis e insuficiencia cardíaca dilatada con fracción de eyección reducida (HFrEF)19. De manera similar, la expresión de Adamtsl3 aumentó 2-3 veces en los LV de ratones WT sometidos a un procedimiento AB recientemente descrito, durante una o seis semanas, utilizando juntas tóricas de diámetro fijo20 (Fig. 1d). Los niveles de proteína ADAMTSL3 no se investigaron debido a la falta de anticuerpos activos en el ratón (Fig. S1a-b).

ab Niveles de ARNm de ADAMTSL3/RPL32 en biopsias del ventrículo izquierdo (LV) de pacientes con estenosis aórtica (AS, n = 11) y miocardiopatía dilatada isquémica (iDCM, n = 9) frente a los controles respectivos. c Western blot y cuantificación de los niveles de proteína ADAMTSL3/proteína total en LV de pacientes con iDCM (n = 8) frente a controles (n = 7). d Niveles de ARNm de Adamtsl3/Rpl32 en LV de ratones de tipo salvaje (WT) 1 y 6 semanas después de la colocación de bandas aórticas (AB) o cirugía simulada (n = 5 simuladas y n = 7 AB en 1 semana, n = 8 simuladas y n = 12 AB a las 6 semanas). e Hibridación in situ del ARNm de Adamtsl3 (tinción roja) en la aurícula izquierda de ratones AB y con operación simulada, y en la pared del VI de ratones AB, 4 semanas después de AB, con contratinción nuclear de hematoxilina (púrpura). f Datos de secuenciación de ARN del portal del proyecto Genotype-Tissue Expression (GTEx). En GTEx, un total de 17382 muestras en 54 tejidos no enfermos, de 948 donantes de órganos humanos fallecidos, representa una población de control. Los donantes tienen entre 20 y 70 años, 33 % mujeres, 85 % blancos y 13 % afroamericanos. La expresión de ADAMTSL3 se muestra como transcripciones por kilobase millón (TPM), en LV (n = 432, mediana TPM = 2,54) y orejuela auricular izquierda (LAA, n = 429, mediana TPM = 9,66). g Niveles de ARNm de Adamtsl3 en fibroblastos cardíacos de rata neonatal (nrCFB) y cardiomiocitos (nrCM), con presencia de células endoteliales (nrEC), aislados de corazones de rata de 1-3 días de edad (n = 3 aislamientos de n = 60 corazones, con n = 3 repeticiones de cultivo por aislamiento). h Niveles de ARNm de Adamtsl3 en nrCFB primarios no tratados y nrCFB estimulados con 5 ng de IFN-γ. Los datos son diagramas de dispersión (a–d, g–h) o diagrama de violín f con media ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t de Student frente a los controles respectivos (a–d, g–h). i Datos del EMBL-EBI Single Cell Expression Atlas. Se muestran todos los grupos con 82 tipos de células de 20 tejidos de ratón (n = 3 hembras y n = 4 machos de 10-15 semanas de edad)22, y se muestran la extracción de células endoteliales, células de músculo cardíaco, fibroblastos y células mesenquimales (progenitores de fibroblastos). y el agrupamiento de la expresión de Adamtsl3 (puntos azules). La barra de escala son recuentos por millón (CPM) de lecturas asignadas.

La hibridación in situ de ARN en corazones de ratones WT confirmó la expresión de Adamtsl3 post-AB tanto en el tejido auricular como ventricular (Fig. 1e), y mostró la expresión de Adamtsl3 en áreas entre cardiomiocitos (CM). De manera similar, ADAMTSL3 se expresó en el VI y el apéndice auricular izquierdo (LAA) (Fig. 1f) de 948 donantes humanos en la base de datos Genotype-Tissue Expression (GTEx)21. Obtuvimos cultivos primarios de corazones de ratas neonatales donde se separaron CFB de CM y se encontraron células endoteliales vasculares (EC) en la fracción de CM11. El análisis de qPCR reveló una alta expresión de Adamtsl3 en CFB frente a CM/EC (Fig. 1g), y su expresión en CFB fue aumentada por interferón-γ (IFN-γ) (Fig. 1h), lo que sugiere que la señalización de IFN-γ estimula la producción de ADAMTSL3 en CFB. Es de destacar que los valores de CT para Adamtsl3 en la fracción CM/EC fueron relativamente altos (Fig. S2) y, por lo tanto, se consideró que la expresión de Adamtsl3 era muy baja en la fracción CM/EC. También extrajimos la base de datos Single Cell Expression Atlas que contiene datos de expresión publicados para 82 tipos de células de 20 tejidos de ratón22. De acuerdo con los datos de nuestros cultivos cardíacos primarios, se observaron niveles altos de ARNm de Adamtsl3 en grupos de fibroblastos y células mesenquimales (progenitores de fibroblastos) (Fig. 1i). Hubo algo de expresión en EC, mientras que la expresión fue insignificante en CM. En base a esto, la señal de Adamtsl3 en la fracción nrCM/nrEC probablemente se originó a partir de EC. Estos conjuntos de datos independientes identifican a los fibroblastos como los principales productores de ADAMTSL3 en corazones humanos, de ratón y de rata.

Usando la edición de genes mediada por CRISPR-Cas9, se generó un alelo de ratón mutante Adamtsl3 (Fig. 2a). Específicamente, una eliminación de 5 pb en el exón 2 (Fig. 2b), que codifica el péptido señal, resultó en una transcripción fuera de marco que eliminó la expresión de Adamtsl3. Los ratones homocigotos y heterocigotos se distinguieron mediante el genotipado Adamtsl3, RNA-seq y qPCR (Fig. S3a-c, respectivamente). Los ratones L3-KO adultos tenían una apariencia aparentemente normal (Fig. S3d) y un peso corporal similar al de los controles WT (Tablas SI-SII). Los ratones homocigotos L3-KO sobrevivieron hasta la madurez sin una letalidad temprana aparente y tenían unas dimensiones y una función cardiacas aparentemente normales, medidas por ecocardiografía y resonancia magnética cardiaca a las 8-12 semanas de edad (Tabla SI). Cabe destacar que los corazones L3-KO pesaban más que los corazones WT (9-13%) y heterocigotos (13,5%) de compañeros de camada (Tablas SI-SII). Los huesos de la tibia L3-KO eran más largos (2-3 %) que los de los compañeros de camada WT y, por lo tanto, se prefirió el peso corporal, que era similar en los tres genotipos, sobre la longitud de la tibia para la normalización del peso de los órganos al inicio (Tablas SI-SII) .

a–b Generación del alelo mutante Adamtsl3. una descripción general del locus Adamtsl3 que muestra los exones codificantes y no codificantes. La edición mediada por CRISPR-Cas9 resultó en una eliminación de 5 pb en el exón 2. b Secuencia alrededor del sitio objetivo de la eliminación de 5 pb. Las secuencias subrayadas indican los cebadores utilizados para el genotipado. c Cronología esquemática del estudio con ratones. Los ratones de tipo salvaje (WT) y Adamtsl3 knock-out (L3-KO) se sometieron a bandas aórticas (AB) o cirugía simulada, y fueron seguidos con ecocardiografía e imágenes por resonancia magnética (IRM) durante 6 semanas. d Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier post-AB. e Cambio en el peso corporal (BW) desde el inicio (%), en WT y L3-KO post-AB o cirugía simulada (n = 8 WT y n = 12 L3-KO). f Peso absoluto del corazón (PC) post-AB. g Masa del ventrículo izquierdo (MVI) post-AB. h Grosor del tabique interventricular en diástole (IVSd), i Grosor de la pared posterior del VI en diástole (LVPWd), j Diámetro interior del VI en diástole (LVIDd), al inicio del estudio y post-AB en comparación con el tratamiento simulado. k Volúmenes telediastólicos del VI (LVEDV) post-AB. l Acortamiento fraccional (FS) al inicio y después de AB. m Fracción de eyección del VI (FEVI) post-AB. n Diámetro de la aurícula izquierda (AI) al inicio en comparación con el simulado. o Peso pulmonar absoluto (LW) en L3-KOs y WTs post-AB. p Péptidos natriuréticos auriculares y cerebrales del VI (Nppa, Nppb) y cadenas pesadas de miosina α y β (Myh6, Myh7) 6 semanas después de cirugía AB o simulada. e-pn = 6 WT y n = 6 L3-KO al inicio, n = 12 WT y n = 8-12 L3-KO post-AB, y n = 7-8 WT y n = 9-12 L3-KO post cirugía simulada. Los datos son la media ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba Log-rank (Mantel-Cox) (d), el ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (e, h–j, l, n, p) o la prueba t de Student ( f–g, k, m, o). Los valores de p se informan como valores de p numéricos o *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 para AB frente a simulado, y $p < 0,05, $$p < 0,01 y $$ $p < 0,001 para L3-KO AB frente a WT AB.

Los compañeros de camada L3-KO y WT fueron sometidos a un aumento de la poscarga del VI mediante AB utilizando juntas tóricas de un diámetro interior fijo de 0,55 mm, con una operación simulada realizada en las cohortes de control correspondientes20. Los ratones se monitorearon con ecocardiografía y resonancia magnética al inicio del estudio y una, tres y seis semanas después de la operación, y los corazones se recolectaron una y seis semanas después de la AB (Fig. 2c). Los ratones L3-KO tuvieron una alta mortalidad después de AB, con una supervivencia del 62 % a las seis semanas, en comparación con la supervivencia del 96 % de los WT y la supervivencia del 100 % de los ratones con operación simulada de ambos genotipos (Fig. 2d). La mayoría de los ratones L3-KO fallecidos murieron con disfunción cardíaca grave tres semanas después de la AB. Ambos genotipos tenían un peso corporal similar al inicio y perdieron peso después de AB frente a los ratones operados de forma simulada, pero los WT recuperaron más peso que los L3-KO durante el transcurso del tiempo posterior a AB (Fig. 2e). A las seis semanas, los L3-KO supervivientes habían perdido el 10 % del peso corporal inicial (Fig. 2e) y, por lo tanto, se terminó el experimento. Esta pérdida de peso corporal fue consistente con un impacto más perjudicial en L3-KO frente a WT post-AB.

Dado que los ratones L3-KO perdieron más peso que los ratones WT después de AB, los pesos de los órganos después de la recolección no se normalizaron con respecto al peso corporal. Los corazones L3-KO recolectados pesaban más después de AB que los corazones WT (Fig. 2f), y tenían una masa VI absoluta mayor calculada a partir de las dimensiones medidas por MRI (Fig. 2g). El grosor del tabique interventricular (IVSd) (Fig. 2h) y el grosor de la pared posterior del VI (LVPWd) (Fig. 2i), medidos por ecocardiografía, fueron similares al inicio y aumentaron en ambos genotipos una semana después de la AB, lo que sugiere un grado similar de hipertrofia. respuesta. Sin embargo, a las seis semanas posteriores a la AB, mientras que la hipertrofia aún era evidente en los WT, las paredes ventriculares eran más delgadas en los L3-KO y no diferían de la línea de base (Fig. 2h-i). El diámetro interno del VI (LVIDd) (Fig. 2j) medido por ecocardiografía, y los volúmenes del VI (LVEDV) (Fig. 2k) medidos por MRI, aumentaron en L3-KOs vs. WTs a lo largo del curso del estudio de una a seis semanas después de la AB, lo que indica una mayor dilatación cardíaca de L3-KO en comparación con los WT (las imágenes de ecocardiografía representativas se muestran en la Fig. S4a-b). Los L3-KO tenían un acortamiento fraccional reducido (FS) frente a los WT (Fig. 2l) y una FEVI reducida (Fig. 2m) desde una semana después de la AB, lo que indica una función contráctil reducida. El diámetro de la aurícula izquierda (LA) (Fig. 2n) y el peso de los pulmones (Fig. 2o) aumentaron en L3-KO seis semanas después de la AB, lo que sugiere congestión circulatoria. Finalmente, la expresión del péptido natriurético auricular (ANP, Nppa), el péptido natriurético cerebral (BNP, Nppb) y la cadena pesada de β-miosina (Myh7) aumentó en L3-KO frente a WT LV a las seis semanas (Fig. 2p), consistente con remodelación y disfunción de cardiomiocitos en curso23. En conjunto, estos datos demuestran que los L3-KO desarrollaron una dilatación cardíaca exacerbada y una disfunción contráctil con una progresión más rápida a la descompensación en comparación con los WT, con una poscarga del VI impuesta por igual.

Para comprender el papel de ADAMTSL3 en respuesta a la sobrecarga de presión del LV, realizamos un análisis de RNA-seq en los LV una semana después de la AB, cuando ambos genotipos mostraron hipertrofia cardíaca, pero solo los corazones L3-KO estaban dilatados (Fig. 2). Se identificaron un total de 233 genes expresados ​​​​diferencialmente (DEG), 138 regulados al alza y 95 regulados a la baja, en L3-KO LV con una tasa de descubrimiento falso (FDR) <0.05 (Datos complementarios 1). Se identificaron 21 vías de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) a partir de los DEG, y las 10 más enriquecidas incluyeron miocardiopatías, función CM e interacciones célula-ECM (Fig. 3a). Los análisis de ontología génica (GO) revelaron el enriquecimiento de 110 vías biológicas, 50 funciones moleculares y 51 categorías de componentes celulares, y de los 10 más enriquecidos, varios relacionados con la contractilidad y la remodelación cardíacas, las interacciones célula-ECM y la señalización de TGFβ (Fig. 3b -d). Por lo tanto, el análisis imparcial de RNA-seq reveló el enriquecimiento de las vías en línea con la disfunción cardíaca exacerbada y un papel regulador de ECM de ADAMTSL3. Es importante destacar que los genes más regulados al alza en los corazones L3-KO incluyeron Nppa y Myh7, en consonancia con la remodelación y disfunción de los cardiomiocitos23, y el colágeno tipo I (Col1a1) y la periostina (Postn), cuyos niveles responden a la señalización de TGFβ e indican un aumento de la fibrosis24 ( Fig. 3e-g). El análisis de la vía de ingenio (IPA, Qiagen) predijo MEF2C y TGFβ como los principales reguladores ascendentes (USR) de los DEG relacionados con CM y CFB, respectivamente (Fig. 3h-i, Datos complementarios 1).

Se indujo una sobrecarga de presión del ventrículo izquierdo (LV) en ratones knock-out Adamtsl3 (L3-KO, n = 10) y de tipo salvaje (WT, n = 6) mediante bandas aórticas (AB) durante 1 semana y secuenciación de ARN se realizó en tejido LV. Se analizaron 233 genes expresados ​​diferencialmente (DEG, FDR < 0,05) para el enriquecimiento de las vías de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) y los términos de ontología génica (GO) utilizando el asistente de análisis de la base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado (DAVID) v6.849 . Se muestran las 10 rutas a KEGG más enriquecidas, rutas biológicas b GO, funciones moleculares c GO y componentes celulares d GO, identificadas entre los 233 DEG. e Diagrama de dispersión que compara lecturas de registro por kilobase millón (RPKM) de 233 DEG entre L3-KO y WT. Los puntos rojos corresponden a los DEG anotados en el gráfico. La lista completa de DEG (puntos grises y rojos) se puede encontrar en Datos complementarios 1. fg Log2 veces el cambio de la RPKM media de DEG relacionados con la estructura y función de los cardiomiocitos (CM) (f), y la matriz extracelular (ECM) y cardiaca. fibrosis (g). hola Reguladores ascendentes previstos de DEG de Ingenuity Pathway Analysis (IPA).

Como el análisis bioinformático de los datos de RNA-seq indicó una mayor actividad de TGFβ en corazones L3-KO una semana después de la AB, medimos los niveles de TGFβ activo y pSMAD2, un mediador crítico de la señalización de TGFβ5, mediante inmunotransferencia. Los niveles de TGFβ activo fueron más altos en los corazones L3-KO que en los WT una y seis semanas después de la AB (Fig. 4a). Después de una semana de AB, pSMAD2 aumentó en L3-KO frente a simulado, y después de seis semanas de AB, pSMAD2 fue mayor en corazones L3-KO frente a WT (Fig. 4b), lo que indica un aumento de la señalización de TGFβ en L3- KO corazones. De acuerdo con esto, los corazones L3-KO mostraron una mayor expresión de TGFβ (Tgfb1) y el objetivo aguas abajo de la señalización de TGFβ, el factor de crecimiento del tejido conectivo (Ctgf) a las seis semanas (Fig. 4c). Postn aumentó de manera comparable en ambos grupos AB, mientras que Ltbp1 no cambió en todos los grupos (Fig. 4c).

Se sometieron a ratones de tipo salvaje (WT) y Adamtsl3 knock-out (L3-KO) a bandas aórticas (AB) o cirugía simulada durante un total de 6 semanas. a,b Inmunotransferencias representativas y cuantificaciones de TGFβ1 activo/proteína total (a) y SMAD2 fosforilado (pSMAD2)/SMAD2 total (b) en lisados ​​de LV, 1 semana (falso: n = 4 WT y n = 4 KO, AB: n = 6-8 WT y n = 12 KO) y 6 semanas (falso: n = 4 WT y n = 4 KO, AB: n = 12 WT y n = 8 KO) post-AB. c Niveles de ARNm/Rpl32 de TGFβ (Tgfb1), factor de crecimiento del tejido conjuntivo (Ctgf), periostina (Postn) y proteína de unión a TGFβ latente 1 (Ltbp1) en ratones AB frente a ratones simulados 6 semanas después de la AB (simulado: n = 8 WT y n = 8 KO, AB: n = 10 WT y n = 7 KO). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, con *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 para AB vs. sham, y $p < 0,05, $$p < 0,01 y $$$p < 0,001 para L3-KO AB frente a WT AB. dk Fibroblastos cardíacos fetales humanos cultivados durante 7 días, produciendo una rica red de matriz extracelular (ECM), y transducidos con ADAMTSL3 (L3) o adenovirus de control (vehículo, Veh) el día 4. Los datos representan experimentos de 3 pases celulares diferentes. d Inmunotransferencia representativa y cuantificación de ADAMTSL3/proteína total en lisados ​​de Veh (n = 9) y L3 (n = 11). e 62 genes regulados a la baja y 22 regulados al alza en muestras agrupadas de ARNm de L3 frente a Veh (n = 18 en ambos grupos) utilizando una matriz de expresión de 84 genes relacionados con TGFβ, los datos son valores de ΔΔCT normalizados a GAPDH. Niveles de f–g mRNA/RPL4 de qPCR de TGFB1, LTBP1, CTGF, POSTN (f) y MALAT1 (g) en L3 (n = 16) frente a Veh (n = 18). h–k Inmunotransferencia representativa y cuantificación de pSMAD2/SMAD2 (h), TGFβ1 activo/proteína total (i), proteína asociada a la latencia (LAP)/proteína total, incluido el complejo latente grande (LLC, > 250 kDa) (j), y proteína de unión a TGFβ latente (LTBP1)/GAPDH, incluida la LLC (k), en lisados ​​de matriz celular y extracelular de L3 (n = 8-9) frente a Veh (n = 8). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t de Student (d, fk). Todos los datos (excepto e) se muestran como diagramas de dispersión de valores individuales con media ± SEM.

Para obtener más información sobre el mecanismo, sobreexpresamos ADAMTSL3 (L3) de longitud completa y un adenovirus de control de vehículo (veh) en cultivos de CFB fetales humanos (hfCFB) (Fig. S5a), que forman una extensa red ECM11. La sobreexpresión de ADAMTSL3 se confirmó mediante un aumento de ARNm (Fig. S5b) y proteína (Fig. 4d). Usando una matriz de expresión dirigida a 84 genes de la vía de señalización de TGFβ en muestras agrupadas de L3 y Veh, encontramos 62 genes regulados a la baja y 22 regulados al alza en L3 (Fig. 4e). Varios mediadores centrales de la señalización canónica de TGFβ, por ejemplo, TGFB1, TGFB2, SMAD3, SMAD4, TGFBR1, estaban regulados a la baja y el inhibidor de la señalización de TGFβ SMAD6 estaba regulado al alza. Al analizar muestras individuales de L3 y Veh, encontramos que los genes que codifican los componentes del gran complejo TGFβ latente (LLC), es decir, TGFB1 y LTBP1, los objetivos de señalización de TGFβ CTGF y POSTN, así como el potenciador de señalización de TGFβ MALAT125, estaban regulados a la baja en L3 (Fig. 4f-g). La inmunotransferencia reveló pSMAD reducido (Fig. 4h) y TGFβ activo reducido (Fig. 4i), lo que indica una señalización de TGFβ reducida. Además, los niveles de LLC, que consisten en el péptido asociado a la latencia (LAP), transcrito del gen TGFB1 y LTBP1, se redujeron en los lisados ​​​​de células L3 y ECM (Fig. 4j-k), lo que indica una producción reducida de TGFβ. En conjunto, los estudios de pérdida de función y ganancia de función sugieren que ADAMTSL3 es un inhibidor de la señalización de TGFβ en el corazón in vivo y en los fibroblastos cardíacos in vitro.

Se realizó una resonancia magnética cardíaca con mapeo de fase tisular (TPM) para evaluar la función miocárdica. Ambos genotipos desarrollaron una tensión máxima longitudinal y circunferencial reducida después de la AB, lo que sugiere una disfunción sistólica (Fig. S6a-b). Además, ambos genotipos desarrollaron una tasa de tensión diastólica temprana (SRe) reducida, lo que indica una relajación menos efectiva (Fig. S6c-d), y a las tres semanas, L3-KO mostró una SRe circunferencial del VI reducida en comparación con WT (Fig. S6d). La ecocardiografía Doppler apoyó el deterioro relativo de la función cardíaca en L3-KO en comparación con WT, ya que la velocidad de entrada mitral máxima (E) (Fig. S6e) y la desaceleración de entrada de la válvula mitral (MVD) (Fig. S6f) se redujeron en L3-KO. La SRe reducida en L3-KO puede reflejar rigidez del VI, que puede estar relacionada con fibrosis miocárdica. Por lo tanto, como siguiente paso, evaluamos los efectos de ADAMTSL3 en la expresión y biosíntesis del gen ECM.

En los datos de RNA-seq, encontramos Col1a1 regulado al alza en L3-KO frente a WT una semana después de AB (Fig. 3g), lo que sugiere una mayor producción de colágeno en este momento. Por lo tanto, buscamos evidencia de fibrosis en secciones del ventrículo medio de ratones WT y L3-KO. Una semana después de la AB, la tinción tricrómica mostró niveles de colágeno comparables en ambos genotipos, es decir, 9 % de colágeno en WT y 11 % de colágeno L3-KO frente a 0,2-0,3 % en los controles simulados (Fig. 5a e imágenes representativas en la Fig. S7a). También cuantificamos el contenido de proteína de colágeno I por los niveles de hidroxiprolina en los LV una semana después de la AB, lo que, de acuerdo con la histología, indicó un aumento similar en el contenido de colágeno en L3-KO y WT después de la AB frente al tratamiento simulado (Fig. 5b) . Seis semanas después de la AB, el ARNm de colágeno I (Col1a1 y Col1a2) y colágeno III (Col3a1) aumentó en un grado similar en ambos genotipos, según lo evaluado con qPCR (Fig. 5c). Del mismo modo, la tinción tricrómica de las secciones del ventrículo medio fue comparable en ambos genotipos, es decir, 5,5 % de colágeno en WT y 6,4 % de L3-KO a las seis semanas posteriores a la AB (Fig. 5d e imágenes representativas en la Fig. S7b). Por lo tanto, no se encontraron diferencias en la cantidad de colágeno tisular entre los genotipos en los dos puntos de tiempo investigados después de la AB.

a-f Los ratones de tipo salvaje (WT) y Adamtsl3 knock-out (L3-KO) se sometieron a bandas aórticas (AB) o cirugía simulada durante 1 y 6 semanas. a % de colágeno total del ventrículo izquierdo (LV), calculado a partir de secciones histológicas del ventrículo medio teñidas con Picrosirius Red, Fast Green y Alcian Blue (RGB) 1 semana después de la AB (Sham: n = 5 WT y n = 5 KO, AB: n = 5 WT y n = 5 KO). b Contenido de colágeno tipo I de LV, medido por HPLC de hidroxiprolina pico, 1 semana después de AB (simulado: n = 6 WT y n = 5 KO, AB: n = 6 WT y n = 7 KO). c Niveles de mRNA/Rpl32 de LV de colágenos tipo I (Col1a1, Col1a2) y tipo III (Col3a1) y lisil oxidasa (Lox) (Sham: n = 8 WT y n = 8 KO, AB: n = 10 WT y n = 7 KO). d LV % colágeno total en secciones del ventrículo medio a las 6 semanas después de AB (simulado: n = 3 WT y n = 3 KO, AB: n = 4 WT y n = 4 KO). e Niveles de colágeno total, colágeno soluble, colágeno insoluble y entrecruzamiento de colágeno en LV 6 semanas después de AB, utilizando procedimientos colorimétricos y enzimáticos en secciones del ventrículo medio (n = 7 WT y n = 7 KO). (f) niveles de ARNm/Rpl32 de fibrilina-1/2 (Fbn1, Fbn2), tropoelastina (Eln1) y fibronectina-1 (Fn1), en L3-KO frente a WT (Sham: n = 8 WT y n = 8 KO, AB: n = 10 WT y n = 7 KO). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (a–d, f) o la prueba t de Student (e). Los valores de p se informan como valores de p exactos o *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 para AB frente a simulado, y $p < 0,05, $$p < 0,01 y $$ $p < 0,001 para L3-KO AB frente a WT AB. g–h, j Se cultivaron fibroblastos cardíacos fetales humanos (hfCFB) durante 7 días, produciendo una rica red de matriz extracelular (ECM), y se transdujeron con ADAMTSL3 (L3) o adenovirus de control (vehículo, Veh) en el día 4. Los datos representan experimentos en 3 pases celulares diferentes. g Valores de expresión de ΔΔCT, normalizados a GAPDH, de 53 genes regulados negativamente y 25 regulados positivamente en muestras agrupadas de ARNm de L3 frente a Veh (n = 18 en ambos grupos) utilizando una matriz de expresión de 78 genes relacionados con la adhesión celular y ECM. Niveles de hRNA/RPL4 de qPCR de COL1A1, COL1A2, COL3A1, LOX en L3 (n = 16) frente a Veh (n = 18). i Síntesis de proteína de colágeno, medida por desintegración radiactiva (recuentos por minuto) de [3H]-prolina, incorporada durante 48 h en L3 y Veh CFB, aisladas de ratas de 1 a 3 días de edad (n = 3 aislamientos con n = 60 corazones dando n = 3-4 repeticiones técnicas por aislamiento). j Niveles de ARNm/RPL4 de qPCR de FBN1, FBN2, ELN y FN1 en L3 (n = 16) frente a Veh (n = 18) hfCFB. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student (hj). Todos los datos (excepto g) se muestran como diagramas de dispersión de valores individuales con media ± SEM.

El ARNm de lisil oxidasa (Lox) aumentó 1,7 veces en L3-KO en comparación con WT seis semanas después de AB (Fig. 5c), lo que podría indicar una mayor reticulación de colágeno en L3-KO. Por lo tanto, analizamos el contenido de colágeno total, soluble e insoluble a las seis semanas después de la AB mediante ensayos colorimétricos y enzimáticos en secciones del ventrículo medio. Es importante destacar que los L3-KO LV tenían niveles más altos de colágeno insoluble frente a WT (Fig. 5e). Sin embargo, la diferencia en el entrecruzamiento de colágeno calculado (proporción entre colágeno insoluble y soluble) no alcanzó significación (p = 0,139) entre genotipos (Fig. 5e).

Para examinar si ADAMTSL3 regula la expresión de ECM in vitro, utilizamos una matriz de expresión dirigida a 78 genes de adhesión celular y ECM, y encontramos 53 genes regulados negativamente y 25 regulados positivamente en muestras agrupadas de L3 frente a Veh. Varios genes de adhesión celular estaban regulados positivamente, por ejemplo, SELL, SELP, PECAM1 y VCAM1. En línea con el aumento de la expresión en los corazones L3-KO AB, COL1A1, ITGB1 y CTGF se regularon a la baja en L3, al igual que varias metaloproteinasas (MMP) y proteasas ADAMTS secretadas y de la matriz de la superficie celular (Fig. 5g). Se confirmó la expresión reducida de COL1A1 en muestras individuales de hfCFB, mientras que COL3A1 no se modificó (Fig. 5h). La producción de proteína de colágeno se investigó más a fondo en L3 vs Veh nrCFB con un ECM en desarrollo (Fig. S5c-d), utilizando la incorporación de prolina radiomarcada. Es importante destacar que encontramos que los cultivos L3 incorporaron un 25% menos de radioprolina que Veh (Fig. 5i), lo que sugiere que ADAMTSL3 inhibe los niveles de proteína de colágeno de fibroblastos cardíacos. De acuerdo con el aumento de la expresión de Lox en corazones L3-KO (Fig. 5c), la sobreexpresión de L3 en hfCFB redujo el ARNm de LOX (Fig. 5h), lo que sugiere que ADAMTSL puede inhibir el entrecruzamiento del colágeno. En corazones L3-KO seis semanas después de AB, la expresión de elastina (Eln) fue 1,8 veces mayor que Veh, mientras que la expresión de fibrilinas (Fbn1/2) y fibronectina (Fn1) no cambió (Fig. 5f). Finalmente, la expresión de microfibrillas se analizó en cultivos de hfCFB que produjeron una extensa red de microfibrillas11 y mostró una expresión reducida de FBN1, FBN2, ELN y FN1 en L3 frente a Veh (Fig. 5j). En particular, las fibrillas de fibronectina apoyan el ensamblaje de colágeno I, microfibrillas de fibrilina, elastina y LTBP-1 en el ECM26. En conjunto, nuestros datos demuestran que ADAMTSL3 afecta la síntesis y el entrecruzamiento de colágeno, así como la síntesis de otras moléculas estructurales de ECM en cultivos de hfCFB y en respuesta a la sobrecarga de presión.

La osteopontina (SPP1) es esencial para la diferenciación de miofibroblastos y se identificó como la molécula más regulada a la baja en la matriz de expresión de L3 frente a Veh (Fig. 5g) y, por lo tanto, examinamos la diferenciación de miofibroblastos en corazones WT y L3-KO. Encontramos niveles de expresión comparables del marcador característico de miofibroblastos α-SMA (Acta2) entre los grupos una semana y seis semanas después de la AB (Fig. 6a), pero la inmunotransferencia para la proteína α-SMA reveló un aumento de 2,5 veces en L3-KO vs. WT una semana después de AB (Fig. 6b), lo que indica una mayor diferenciación de miofibroblastos. La expresión de SPP1 aumentó en ambos genotipos después de AB, con niveles más altos en corazones L3-KO frente a WT (Fig. 6c), lo que se confirmó aún más a nivel de proteína (Fig. 6d). La expresión de ACTA2 se redujo en un 40 % en cultivos L3 hfCFB en comparación con Veh (Fig. 6e), y la proteína α-SMA se redujo en un 25 % (Fig. 6f). Confirmamos SPP1 regulado a la baja en muestras individuales L3 hfCFB al 10% de los niveles de Veh (Fig. 6g) y una reducción del 40% en la proteína osteopontina en comparación con Veh (Fig. 6h), lo que indica una diferenciación de miofibroblastos reducida. A continuación, se investigaron las características profibróticas de los CFB activados, es decir, la proliferación y la capacidad adquirida para contraer ECM6, lo que reveló una expresión reducida de los marcadores de células proliferativas: antígeno nuclear de células proliferativas (PCNA), Ki-67 (KI67) y mini- componente 2 del complejo de mantenimiento cromosómico (MCM2) en L3 (Fig. 6i), así como una incorporación reducida de EdU (Fig. 6j). Lo más significativo es que las células que sobreexpresan ADAMTSL3 mostraron una capacidad reducida para contraer geles de colágeno (Fig. 6k), lo que proporciona una lectura funcional de la diferenciación de miofibroblastos alterada.

Se sometieron ratones de tipo salvaje (WT) y Adamtsl3 knock-out (L3-KO) a bandas aórticas (AB) o cirugía simulada durante 1 y 6 semanas. a Niveles de mRNA/Rpl32 de α-actina de músculo liso (α-SMA, Acta2). b Inmunotransferencias representativas y cuantificación de α-SMA en extractos de proteína LV de WT y L3-KO 1 y 6 semanas después de cirugía AB o simulada. c Niveles de ARNm/Rpl32 de osteopontina (OPN, Spp1). d Inmunotransferencias representativas y cuantificación de OPN en extractos de proteína LV de WT y L3-KO 1 y 6 semanas después de cirugía AB o simulada. 1 semana después de AB, n = 4-5 WT y n = 4 KO simulado, y n = 6–7 WT y n = 8–9 KO AB. A las 6 semanas después de AB, n = 4-8 WT y n = 4-8 KO simulado, y n = 10-12 WT y n = 7-8 KO AB. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (ad). Los valores de p se informan como *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 para AB frente a simulado, y $p < 0,05, $$p < 0,01 y $$$p < 0,001 para L3-KO AB frente a WT AB. e-k Se cultivaron fibroblastos cardíacos fetales humanos (hfCFB) durante 7 días, produciendo una rica red de matriz extracelular (ECM), y se transdujeron con ADAMTSL3 (L3) o adenovirus de control (vehículo, Veh) en el día 4. Los experimentos se realizaron en 3 diferentes pasajes celulares. e Niveles de ACTA2/RPL4 en L3 (n = 16) vs Veh (n = 18). f Inmunotransferencia representativa y cuantificación de α-SMA/GAPDH en L3 (n = 8) frente a Veh (n = 8). g Niveles de SPP1/RPL4 en L3 (n = 16) vs Veh (n = 18). f Inmunotransferencia representativa y cuantificación de OPN/proteína total en L3 (n = 8) frente a Veh (n = 8). i niveles de ARNm/RPL4 del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), marcador de proliferación Ki-67 (KI67) y componente 2 del complejo de mantenimiento de minicromosomas (MCM2) en L3 (n = 18) vs Veh (n = 18). j Unidades de fluorescencia relativas (RFU) que reflejan la incorporación de EdU, como medida de proliferación, en L3 frente a Veh (n = 48). Los datos se dan con la media ± SEM (a–j). k Contracción del gel de colágeno de hfCFB, como % de contracción del área inicial del gel, a las 2, 4 y 6 h, en L3 (n = 12) frente a Veh (n = 24). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student (p–k), con valores de p informados como valores numéricos (e–j) o **p < 0.01 y ***p < 0.001, y las medidas repetidas de dos vías ANOVA con la corrección de Geisser-Greenhouse para la comparación de múltiples puntos de tiempo (k, valor p exacto que se muestra en el gráfico).

En línea con la contractilidad reducida en corazones L3-KO después de AB, RNA-seq reveló sarcómero CM desregulado y genes de contractilidad, por ejemplo, el receptor de rianodina (Ryr2), titina (Ttn), intercambiador de sodio-calcio (NCX, Slc8a1), SERCA (Atp2a2) y fosfolambano (Pln) (Fig. 3e-g). Por lo tanto, investigamos CM aislados de ratones adultos WT y L3-KO. Los CM tenían un tamaño similar entre los genotipos (Fig. S8a), con una longitud de sarcómero en reposo comparable (Fig. S8b). Durante la estimulación eléctrica a 1 Hz, los CM exhibieron magnitudes de contracción similares, con un acortamiento de células paralelo por provocación con isoproterenol (Fig. S8c) y una cinética similar de contracción (Fig. S8d) y relajación (Fig. S8e), lo que sugiere un desarrollo normal de CM en L3- KO corazones. Como el fenotipo de los CM aislados fue similar en WT y L3-KO, y no se detectó la expresión de Adamtsl3 en los CM (Fig. 1i), la disfunción contráctil exacerbada observada en L3-KO después de AB se interpretó como secundaria a ECM y CFB alterados. función.

En el presente estudio, investigamos la regulación de ADAMTSL3 en biopsias de pacientes con insuficiencia cardíaca y su papel en la remodelación cardíaca después de la sobrecarga de presión del VI inducida por AB en ratones compañeros de camada L3-KO y WT. ADAMTSL3 se reguló positivamente en corazones defectuosos de pacientes y ratones después de AB, y fue producido principalmente por CFB. Es importante destacar que los ratones L3-KO demostraron disfunción contráctil exacerbada y dilatación del LV, con una mayor mortalidad después de la sobrecarga de presión del LV. Los análisis moleculares de los corazones L3-KO y WT posteriores a la AB revelaron una mayor señalización de TGFβ, activación de CFB y producción desregulada de ECM, con mayores niveles de colágeno insoluble en L3-KO. La sobreexpresión de ADAMTSL3 en CFB cultivados inhibió la señalización de TGFβ, la conversión de miofibroblastos, la expresión de ECM y la síntesis de colágeno. En conjunto, nuestros datos sugieren un papel cardioprotector para ADAMTSL3 en el corazón defectuoso, a través de la inhibición de la actividad de TGFβ y la diferenciación de miofibroblastos, con consecuencias para la ECM cardíaca, la remodelación cardíaca y la función ante estímulos patógenos.

Los niveles de ADAMTSL3 aumentaron en biopsias de corazón de pacientes con insuficiencia cardíaca y nuestros estudios en ratones demuestran un papel importante de ADAMTSL3 para la función cardíaca y la supervivencia. Después de la sobrecarga de presión del VI, el L3-KO desarrolló disfunción contráctil exacerbada y dilatación cardíaca. RNA-seq de corazones post-AB reveló DEG asociados con cardiomiopatía, manejo de calcio CM y contractilidad en L3-KO. Dado que no detectamos la expresión de Adamtsl3 en CM, y no se observaron diferencias en la función de CM entre L3-KO y CM WT aislados, interpretamos la función cardíaca reducida en L3-KO como secundaria a la regulación alterada de ECM por CFB.

Al inicio, los ratones L3-KO eran viables y tenían un peso corporal normal sin fenotipo aparente, excepto por extremidades ligeramente más largas. Aunque la función o las dimensiones cardíacas basales, medidas por ecocardiografía y resonancia magnética, no se vieron afectadas por la inactivación de Adamtsl3, los corazones de los ratones L3-KO sin estrés aumentaron de peso. Esto indica que la interpretación del fenotipo cardíaco posterior a AB debe realizarse con precaución, ya que los corazones L3-KO pueden estar predispuestos a una enfermedad exacerbada en respuesta a un factor estresante.

Importantly, our study directly links ADAMTSL3 to cardiac function. This link was previously suggested, as ADAMTSL3 is part of a rare syndrome known as Tetrasomy 15q25, arising from an inverted duplication of the distal chromosome 15qter identified with SNP microarray in a patient with multiple anomalies including complex cardiovascular malformation. Am. J. Med. Genet. A 158a, 1971–1976 (2012)." href="/articles/s42003-022-04361-1#ref-CR27" id="ref-link-section-d79610379e2679"> 27,28. Las características de los pacientes incluyen anomalías del crecimiento y malformaciones cardíacas complejas asociadas con una alta mortalidad28. Los defectos cardíacos fenotípicos sólo aparecen cuando ADAMTSL3 forma parte de la duplicación cromosómica28. También se informan defectos cardíacos en pacientes con una microdeleción cromosómica heterocigota de la misma región, incluido ADAMTSL329,30.

La relación funcional entre los miembros de la familia ADAMTSL y las microfibrillas de fibrilina13,15,17 sugiere que las ADAMTSL actúan como reguladores de TGFβ, una función anteriormente demostrada para ADAMTSL211,31 y ADAMTSL614. Nuestro estudio se suma al creciente cuerpo de evidencia que implica a las proteínas ADAMTSL en la regulación de TGFβ, ya que aquí mostramos mayores niveles y actividad de TGFβ en corazones L3-KO post-AB, e inhibición de TGFβ en CFB cultivados que sobreexpresan ADAMTSL3. Como TGFβ es un regulador importante de la activación de CFB y la producción de ECM profibrótica en el corazón defectuoso7,32, esto puede sugerir que ADAMTSL3 es un regulador negativo de la señalización fibrótica y patogénica en el corazón. ADAMTSL3 reguló la activación de CFB en corazones de ratones, así como en CFB humanos cultivados, que se muestra por niveles alterados de los marcadores de miofibroblastos α-SMA y osteopontina, junto con una contracción de CFB alterada en respuesta a la sobreexpresión de ADAMTSL3. En CFB humanos cultivados, la sobreexpresión de ADAMTSL3 resultó en una expresión alterada de moléculas de ECM, incluido el colágeno. Aunque no observamos cambios en el colágeno total en los corazones in vivo, la inactivación de Adamtsl3 resultó en una alteración de la calidad de la MEC en el miocardio, con mayores niveles de colágeno insoluble, que especulamos podría atribuirse a una mayor expresión de Lox. La evidencia reciente sugiere que el corazón defectuoso contiene poblaciones distintivas de CFB activados, que tienen características variables, como alta contracción o alta producción de colágeno4,33. Especulamos que ADAMTSL3 puede afectar la diferenciación de poblaciones específicas de miofibroblastos que remodelan el miocardio de formas distintas a la mera producción de colágeno. De hecho, se han identificado más de 30 genes ECM desregulados en miofibroblastos activados de corazones lesionados34. Después de la sobreexpresión de ADAMTSL3 en CFB, encontramos una expresión reducida de FBN1, FBN2, FN1 y ELN, lo que sugiere la regulación de las proteínas ECM que secuestran el complejo TGFβ latente. La expresión de Eln aumentó correspondientemente en los corazones L3-KO.

El TGFβ ha sido atractivo durante mucho tiempo como un objetivo terapéutico potencial en la enfermedad cardíaca, sin embargo, la traducción clínica está limitada por los efectos adversos32 y se justifican estrategias alternativas para la inhibición de la vía del TGFβ35. Además, se ha demostrado que la diferenciación de miofibroblastos es reversible en el corazón defectuoso35 y puede ser un objetivo de tratamiento importante. Queda por demostrar si ADAMTSL3 tiene potencial terapéutico para inhibir la diferenciación de miofibroblastos. Mecánicamente, ADAMTSL3 se une a fibrilina-1 y LTBP113, lo que indica un mecanismo potencial de regulación de la actividad de TGFβ. Sugerimos que ADAMTSL3 restringe la biodisponibilidad de TGFβ en la ECM, posiblemente junto con ADAMTSL211. Además, proponemos IFN-γ, un regulador negativo de TGFβ y señalización profibrótica en el corazón36,37, como un regulador aguas arriba de ADAMTSL3.

En conclusión, el aumento de la mortalidad y el fenotipo cardíaco exacerbado de los ratones L3-KO después de la sobrecarga de presión sugieren un papel cardioprotector para ADAMTSL3 en el corazón defectuoso. Mecánicamente, nuestros resultados indican que ADAMTSL3 apoya la función cardíaca a través de la limitación de la activación de TGFβ y la diferenciación de miofibroblastos. En investigaciones futuras, esta posibilidad podría abordarse aumentando los niveles de ADAMTSL3 de forma experimental en modelos de enfermedades cardíacas, para revelar posibles efectos cardioprotectores.

El uso de biopsias cardíacas humanas fue aprobado por el Comité Regional para la Ética de la Investigación Médica (REK ID 07482a y 2010/2226) de la Autoridad Regional de Salud del Sudeste, Noruega, y está de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Todos los pacientes, o los familiares de los controles de donantes, firmaron un consentimiento informado por escrito. Las biopsias se obtuvieron en el Hospital Universitario de Oslo (OUH) y todos los pacientes recibieron una evaluación clínica estándar, tratamiento y seguimiento de acuerdo con las pautas del hospital. Los modelos de ratón y los experimentos fueron aprobados por la Cleveland Clinic IACUC (número de protocolo 2020-2450) y el Comité Nacional de Investigación Animal de Noruega (aprobación ID 16614) y cumplieron con la Guía NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio, así como con las pautas ARRIVE para informar sobre investigaciones con animales.

De los pacientes con AS sintomática, se tomaron biopsias de la pared libre del VI (n = 11) durante una cirugía a corazón abierto para el reemplazo de la válvula aórtica. Se tomaron biopsias del LV de control (n = 11) de tejido que se contrae normalmente de pacientes sometidos a cirugía por arteriopatía coronaria. Las características de los pacientes fueron descritas previamente18. En resumen, todos los pacientes tenían FE > 50%. Los pacientes con AS tenían VI no dilatado (LVIDd 4,81 ± 0,23 cm) y paredes VI hipertróficas (IVSd 1,26 ± 0,06 cm y LVPWd 1,22 ± 0,07 cm). Debido al material de muestra limitado, solo se aisló ARN de esta cohorte.

Se obtuvieron biopsias del VI de pacientes con MCD isquémica secundaria (n = 20) de corazones latiendo inmediatamente después de la explantación. Tejido LV de corazones no enfermos considerados para trasplante, pero rechazados por razones quirúrgicas, sirvieron como controles (n = 3 muestras de ARN y n = 7 de proteína). Las características del paciente y del donante fueron descritas previamente19. En resumen, los corazones estaban dilatados (LVIDd 7,41 ± 0,22 cm), tenían función sistólica reducida (FEVI de 19,2 ± 1,6%) y las paredes no estaban hipertróficas (IVSd 0,81 ± 0,05 cm y LVPWd 0,71 ± 0,02 cm, respectivamente). Las muestras de tejido se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70 °C.

Se generó un nuevo alelo mutante Adamtsl3 en ratones C56BL/6 J usando CRISPR/Cas9. Se seleccionó un ARN guía (ARNg) con la secuencia 5' CAGCCACCAGGATCCTGTCC 3' (secuencia del motivo adyacente del protoespaciador (PAM) subrayada) para dirigirse al exón 2 (el péptido señal) del gen Adamtsl3 (ENSMUST00000173828.2). El ARNg fue transcrito in vitro por Applied StemCell Inc (Milpitas, CA, EE. UU.) para generar moléculas de ARNg individuales. La secuenciación de Sanger de la región diana amplificada por PCR indicó una actividad del 62,5 %. En consecuencia, este ARNg junto con la proteína Cas9 se inyectó en embriones C57BL/6 J que se transfirieron a madres CD1 sustitutas y se analizaron mediante amplificación por PCR posterior de la región objetivo utilizando ADN genómico y análisis de secuencias. Se retuvo un ratón fundador con una deleción de 5 pb validada por secuencia de Sanger, con transmisión de línea germinal del alelo mutante, y se cruzó con la cepa C57BL/6 J. Las biopsias de oído WT y L3-KO se genotipificaron utilizando el cebador directo WT: 5'-GGCTTCCTGGACAGGATCC-3', o el cebador directo L3-KO: 5'-CCCATGGCTTCCTGGATCC-3', y un cebador inverso común: 5'-GGGTGTGTTAACAGTGAATCC- 3', en dos reacciones de PCR separadas, con productos de PCR resultantes de 428 pb (Fig. S3a). La expresión extirpada de Adamtsl3 en corazones L3-KO se confirmó mediante RNA-seq (Fig. S3b) y RT-qPCR (Fig. S3c) de tejido LV.

La sobrecarga de presión cardíaca por el aumento de la poscarga del VI fue inducida en compañeros de camada machos L3-KO y WT de 8 a 11 semanas de edad por un cirujano de ratones experimentado que desconocía el genotipo. La banda de alta precisión de la aorta ascendente (AB) se realizó utilizando un procedimiento mejorado, como se describió recientemente, con juntas tóricas de nitrilo de un diámetro interno fijo (0,55 mm)20 en lugar de una sutura, lo que resultó en una restricción del flujo sanguíneo reproducible. baja mortalidad postoperatoria y fenotipos cardíacos consistentes. Los ratones se anestesiaron respirando oxígeno con isoflurano al 4 % en una cámara y se intubaron y ventilaron respirando isoflurano al 2 % durante una cirugía AB o simulada. Se administraron inyecciones subcutáneas de 0,3 mg/ml de buprenorfina (0,1 mg/kg) antes y después de la cirugía. Se administraron analgésicos adicionales a los animales que mostraron algún signo de dolor durante las siguientes 24 h.

La ecocardiografía se realizó al inicio y una, tres y seis semanas después de la AB. Los animales fueron anestesiados en una cámara con isoflurano al 4% y la anestesia se mantuvo respirando isoflurano al 1-2% a través de una máscara. Las dimensiones cardíacas fueron capturadas por un operador ciego y experimentado utilizando el sistema de imágenes VEVO 2100 (VisualSonics, Toronto, Canadá). El análisis de las imágenes de ecocardiografía se realizó de forma ciega al genotipo utilizando el software de análisis de ultrasonido Vevo LAB (VisualSonics).

Se realizó una resonancia magnética nuclear (RMN) al inicio y una y tres semanas después de la AB. Los animales fueron anestesiados en una cámara con isoflurano al 4% y la anestesia se mantuvo con isoflurano al 1-2%. Las adquisiciones fueron controladas prospectivamente por respiración y activadas por R-peak. Durante el examen se controlaron el electrocardiograma (ECG), la frecuencia respiratoria y la temperatura corporal. La adquisición de la RM se realizó con un imán de 9,4 T (Bruker, EE. UU.) con una bobina de radiofrecuencia Rapid QUAD de 35 mm. Se adquirió un corte de secuencia CINE de eje largo de 4 cámaras, así como una pila de cortes de eje corto que cubrían el VI. Los parámetros de imagen fueron: tiempo de ecocardiografía = 1,7 ms (eje largo) y 2,05 ms (eje corto), tiempo de repetición = 5,0 ms (eje largo) y 4,7 ms (eje corto), campo de visión = 25 mm× 25 mm, matriz = 128 píxeles x 128 píxeles, espesor de corte = 1,0 mm, ángulo de giro 15°, promedio de señal = 3 veces, duración total de la adquisición = 1-2 min (eje largo) y 6-10 min (eje corto) ). Adquirimos una grabación de mapeo de fase tisular (TPM) de eje corto de 4 cámaras y una de eje corto medioventricular usando detección comprimida38. Los parámetros TPM fueron: tiempo de ecocardiografía = 1,7 ms, tiempo de repetición = 3,5 ms, campo de visión = 25 mm × 25 mm, matriz = 96 × 24 píxeles (4x submuestreo, 96 × 96 después de la reconstrucción), espesor de corte = 1 mm , ángulo de giro =10°, para un tiempo total de adquisición de aproximadamente 1,5-3 min por corte, dependiendo de la frecuencia cardíaca. El análisis se realizó a ciegas utilizando scripts internos de MATLAB como se describió anteriormente39.

Los animales se anestesiaron en una cámara con isoflurano al 5 % y se extrajeron corazones y pulmones latiendo de animales bajo anestesia terminal profunda respirando isoflurano al 5 % a través de una máscara. Los LV se extirparon, se enjuagaron en PBS, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70 °C.

Corazones de ratones operados con AB o simulados se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4 % y se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones de parafina de 7 μm y se detectó ARNm de Adamtsl3 usando hibridación in situ con la tecnología RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Cat. No. 465521). Se utilizó un horno HybEZ para la hibridación y el kit de detección 2.5 HD Red para la visualización. El tejido se contrastó con hematoxilina. Se utilizó un microscopio Olympus BX51 (Olympus, Center Valley, PA) con una cámara Leica DFC7000T para obtener imágenes con el software Leica Application Suite v4.6.

El tejido LV ultracongelado se fijó en PFA al 4 % y se incrustó en parafina. Se tomaron secciones del ventrículo medio de 7 µm de espesor en portaobjetos de vidrio Superfrost Plus (Fisher) utilizando un micrótomo Leica RM2255. A continuación, estos portaobjetos se tiñeron con tinción tricrómica Picrosirius Red, Fast Green y Alcian Blue (RGB) como se describe detalladamente40, para visualizar la proteína de colágeno en las secciones. Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio vertical Olympus BX51 con una cámara Leica DFC7000T y el software de imágenes Leica Application Suite v4.6. Las áreas con colágeno, según los umbrales de color, se detectaron automáticamente a partir de imágenes tricrómicas RGB mediante una macro personalizada Fiji ImageJ 1.53c (NIH, EE. UU.), que calculó el porcentaje de fibrosis. Se aplicó la misma macro a todas las imágenes de ambos genotipos en ambos momentos.

El análisis cuantitativo de hidroxiprolina en LV de ratón, una medida del contenido de proteína de colágeno, se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con el kit AccQ-Fluor (Cat # WAT052880, Waters, MA, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se homogeneizaron 15 mg de tejido en nitrógeno líquido, se hidrolizaron durante la noche en HCl 6 M a 112 °C, se secaron y derivatizaron con el tampón de borato AccQ-Fluor (Waters). Los derivados se separaron mediante HPLC de fase inversa con el sistema Ultimate 3000 (Nerliens Meszansky, Oslo, Noruega) y se cuantificaron por detección de fluorescencia, con estándares de hidroxiprolina (Fluka, Buchs SG, Suiza).

El colágeno insoluble en las secciones del ventrículo medio se midió utilizando un ensayo colorimétrico verde rápido/rojo picrosirio, restando el colágeno soluble del colágeno total. El colágeno total se midió como se describió anteriormente41 y se utilizó un ensayo enzimático basado en Sircol (Biocolor, Reino Unido) para cuantificar el colágeno soluble42. La reticulación del colágeno se calculó como la proporción de colágeno insoluble y soluble. Todas las mediciones fueron realizadas por duplicado por un investigador experimentado, ciego al genotipo. La cantidad de colágeno se normalizó a la proteína total.

Se aislaron cardiomiocitos LV de ratones WT y L3-KO como se describió previamente43. En resumen, se canularon corazones recién extirpados a través de la aorta en una configuración de Langendorff de flujo constante, perfundidos con tampón de aislamiento que contenía (en mmol/L): 130 NaCl, 5,4 KCl, 25 HEPES, 0,5 MgCl2, 0,4 NaH2PO4 y 22 glucosa, pH 7,40 , 37°C. Después del lavado, los corazones se digirieron mediante perfusión con una solución de colagenasa tipo 2 de 2,0 mg/ml (290 unidades/mg, Worthington Biomedical Corp., Lakewood, NJ, EE. UU.) durante 6 min. El VI se diseccionó y se agitó con 0,2 mg de ADNasa (Worthington) y 250 µl de BSA (40 mg/ml). Las células se filtraron a través de una malla de 200 µm y se sedimentaron. El sedimento se lavó dos veces y los niveles de Ca2+ se incrementaron gradualmente hasta 0,2 mM. Los CM aislados se sembraron en una cámara en un microscopio invertido (Observer D1, Zeiss, Alemania) y se superfundieron continuamente con tampón Hepes Tyrode (37 °C) que contenía (en mmol/L): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl2, 0,5 MgCl2, 5,0 Hepes, 5,5 glucosa, 0,4 NaH2PO4, pH 7,40. Durante las grabaciones, las células se marcaron a 1 Hz. Las posiciones de los sarcómeros se registraron utilizando un objetivo de agua de 63 x/1,2 W (Objective C-Apochromat, Zeiss, Alemania) y una cámara de alta velocidad (Cámara digital CMOS C11440-22CU, Hamamatsu, Japón) a una velocidad de fotogramas de 2 ms. Las contracciones individuales de los sarcómeros se analizaron mediante Image J (NIH), Clampfit (Axon Instruments) y secuencias de comandos de Python personalizadas. En resumen, las imágenes de campo claro se invirtieron y filtraron mediante un filtro de paso de banda FFT (Fast Fourier Transform). Se seleccionó una región que contenía 10-15 sarcómeros. Se promedió la intensidad de cada línea de píxel vertical y se obtuvieron las posiciones de la línea Z (valor máximo) mediante una curva de ajuste usando funciones parabólicas. Al restar las posiciones vecinas de la línea Z, se obtuvieron contracciones de sarcómero único y se normalizaron a SL en reposo para obtener un acortamiento fraccional. Los datos se promediaron entre 10 y 15 sarcómeros en cada celda y entre 3 contracciones consecutivas.

Los CM primarios de rata neonatal (nrCM) y los CFB (nrCFB) se aislaron como se describió anteriormente44. Brevemente, se recogieron corazones latiendo de ratas Wistar de 1-3 días de edad (Janvier Labs) después de la decapitación. Los ventrículos se extirparon y se digirieron con una solución de pancreatina/colagenasa. La población de células adherentes se aisló de las células no adherentes mediante la unión de 20 minutos a matraces de cultivo sin recubrir. Según los análisis de microscopía y qPCR11, estas células eran principalmente CFB. Los CFB se cultivaron durante una semana, luego se colocaron en placas a 3,8 × 104 células/cm2 en placas de seis pocillos y se cultivaron durante otra semana antes de la cosecha. La fracción de células no adheridas, principalmente CM, pero con presencia de ECs11, se sembró a 3,8 × 104 células/cm2 en placas de seis pocillos recubiertas con gelatina y fibronectina. Todas las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco que contenía suero (Gibco), en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % a 37 °C. ADAMTSL3 se sobreexpresó en CFB de rata neonatal usando un vector de adenovirus humano deficiente en replicación del serotipo 5 (Ad5 dE1/E3) que codifica ADAMTSL3 (Genbank RefSeq BC128389) bajo el promotor (L3) del citomegalovirus (CMV) o un vehículo de control (Ad5 dE1/E3 -CMV-Null) (Veh) (ambos disponibles comercialmente de Vector Biolabs, PA, EE. UU.). Las células se sembraron y transdujeron después de 24 h (día 1) en un protocolo de cultivo de 4 días (Fig. S5a), en el que las células depositan una red ECM inmadura en desarrollo11. La transducción se realizó en medio de crecimiento con un título de virus de 5 × 106 unidades formadoras de placa (PFU), lo que da una multiplicidad de infección (MOI) de 100. El medio de crecimiento se cambió a medio sin suero 24 h después de la transducción. La sobreexpresión exitosa se verificó mediante el aumento del ARNm de Adamtsl3 en células de control L3 frente a Veh (Fig. S5b). Para la estimulación con IFN-γ, las células se cultivaron en medio sin suero durante 24 h y se agregaron 5 ng/mL de IFN-γ recombinante (Z03274, GenScript, NJ, EE. UU.) 3 h antes de la cosecha.

Se obtuvieron fibroblastos cardíacos fetales humanos (hfCFB) de Cell Applications, Inc (n.° de cat. 306-05 f) y se cultivaron en medio Cardiac Fibroblast Growth (n.° de cat. 316-500, Cell Applications) o medio basal de fibroblastos (n.° de cat. 115-500, Cell Applications), ambos suplementados con penicilina/estreptomicina al 1%, en una incubadora humidificada con CO2 al 5% a 37˚C. Las células se sembraron en placas a 10.000 células/cm2 para los experimentos, a menos que se indique lo contrario. Se utilizó un protocolo de cultivo único de hfCFB, en el que las células desarrollan una ECM madura, incluidos los componentes del sistema TGFβ, como se describió anteriormente11. Brevemente, las células se cultivaron durante un total de siete días y se transdujeron el día 4 con L3 o Veh a 5 × 106 PFU. Después de 24 h, el medio de transducción se cambió a medio basal sin suero (Fig. S5c). La sobreexpresión exitosa se verificó mediante el aumento del ARNm de ADAMTSL3 en células de control L3 frente a Veh (Fig. S5d).

El ensayo de contracción del gel de colágeno se realizó esencialmente como se describe11. Los hfCFB transducidos con L3 o Veh se tripsinizaron, centrifugaron y resuspendieron en medio sin suero. Las células se mezclaron con una solución de colágeno que contenía 3 mg/mL de colágeno I bovino (Bovine PureCol®, Advanced BioMatrix), 2x DMEM (Merck Millipore) y 0,2 M HEPES (pH 8), y se sembraron en placas a 36,5 × 103 células/cm2 en 24 -placas de pocillos, recubiertas previamente con BSA al 2 % en PBS durante la noche a 37 °C. Los geles de colágeno polimerizaron durante 2 h a 37 °C y se añadió medio sin suero para separar los geles. La circunferencia de los geles, correspondiente a la cantidad de contracción del gel, se midió 6 y 24 h después, utilizando ImageJ 1.53c (NIH).

Los nrCFB se sembraron en placas de 12 pocillos y se transdujeron con Veh o L3 después de 24 h. El medio se cambió después de 24 h a medio sin suero que contenía 50 µM/ml de ácido ascórbico y 1 µCi de L-[2,3-3H]-prolina (Cat# NET323001 MC, PerkinElmer, Inc, MA). En el día 4, las células se lavaron con PBS frío, se lisaron en NaOH 1 M y se diluyeron usando el cóctel de centelleo líquido OptiPhase HiSafe 3 (Cat# 1200.437, PerkinElmer). La cantidad de prolina radiomarcada presente en cada muestra, como sustituto de la biosíntesis de la proteína de colágeno45, se midió como cuentas por minutos (CPM) utilizando el contador de centelleo líquido Wallac Winspectral 1414 (PerkinElmer).

Los hfCFB transducidos con L3 o Veh se colocaron en placas a 1000 células/mm2 en placas de 96 pocillos (Cat# 6005430, Perkin Elmer). Las células se marcaron con EdU 10 µM durante 2 h, después de 24 h de privación de suero. Las células se fijaron mediante el ensayo de proliferación EdU Click-iT™ (n.° de catálogo C10499, CyQUANT, Invitrogen) y la fluorescencia de EdU se midió en el lector de microplacas Hidex Sense (LabLogic Systems, Sheffield, Reino Unido), básicamente como se describe11.

El ARN total se aisló a partir de tejido cardíaco o células cultivadas con el kit RNeasy Mini (Cat# 74106, Qiagen Nordic, Noruega). El kit de síntesis de cDNA iScript (n.º de catálogo 1708891, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) se usó para la transcripción inversa y la generación de cDNA a partir de RNA aislado. La expresión génica relativa en cada muestra se determinó utilizando ensayos de expresión génica TaqMan (Tabla SIII) y matrices de expresión génica TaqMan prefabricadas para la vía TGFB (n.º de cat. 4414097) y moléculas de adhesión y matriz extracelular humana (n.º de cat. 4414133), con TaqMan Universal PCR Master Mix (n.° de catálogo 4304437). Se utilizó el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3 (Applied Biosystems, Foster City, CA) para la amplificación y detección por PCR.

La secuenciación de ARN (RNA-seq) se realizó en tejido LV aislado de corazones WT (n = 6) y L3-KO (n = 10) una semana después de AB, de manera similar a lo descrito anteriormente46. Brevemente, el ARN total se aisló utilizando el reactivo TRI (Sigma Aldrich) mediante extracción con fenol-cloroformo. El tejido LV se homogeneizó en 1 ml de reactivo TRI utilizando el Tissuelyzer II (Qiagen). El ARN ribosómico se eliminó utilizando el kit de agotamiento de ARNr NEBNext® (humano/ratón/rata, New England Biolabs). Se generaron bibliotecas de RNA-seq de cadena total utilizando el kit de preparación de bibliotecas de RNA-Seq total de CORALL (Lexogen), con perlas AMPure (Beckman Coulter) para la purificación. Control de calidad de bibliotecas de RNA-seq con el Bioanalizador 2100 (Agilent). El control de calidad y la secuenciación se llevaron a cabo en las instalaciones de secuenciación de próxima generación del Instituto Babraham, Cambridge, Reino Unido. Las bibliotecas de RNA-seq se secuenciaron en un carril de HiSeq2500 (Illumina) con el ciclo de secuenciación de extremo único HiSeq2500-RapidRun de 100 pb. Los datos de RNA-seq se alinearon usando HiSAT247 con el genoma de referencia de Mus musculus GRCm38/mm10. Las lecturas se recortaron antes de la alineación utilizando Trim Galore, con una puntuación de calidad de Phred para el corte de llamada base de 20, lo que corresponde a un error máximo de 1 en 100 bases, y con una tasa de error de recorte máxima de 0,1. Los archivos de secuencia recortados y alineados se importaron como archivos BAM en SeqMonk (v1.42.0) para su visualización y análisis. Las lecturas de RNA-seq se cuantificaron mediante la cuantificación del recuento de lecturas y la normalización global realizada hasta el recuento total de lecturas para cada biblioteca y se expresaron como lecturas por kilobase millón (RPKM). El análisis de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) se realizó utilizando el software basado en R DESeq248. Se usaron recuentos de lectura sin procesar (transformados sin registros) como entrada y se realizó una normalización global al tamaño total de la biblioteca.

Los datos de expresión de células Adamtsl3 de ratón se obtuvieron de la base de datos Single Cell Expression Atlas (https://www.ebi.ac.uk/gxa/sc/home), EMBL-EBI, Cambridgeshire, Reino Unido, consultada el 31.05.2022)22. Los datos de expresión humana de ADAMTSL3 de LAA y LV de donantes de órganos fallecidos se obtuvieron del GTEx Project Portal (https://gtexportal.org/home), Broad Institute, Boston, MA, consultado el 31/05/2021). Los gráficos fueron modificados a partir de las funciones gráficas interactivas de las bases de datos.

Las proteínas se extrajeron de tejido cardíaco humano y de ratón de acuerdo con un protocolo previamente descrito20,44, con un tampón de lisis basado en PBS que contenía Triton X-100 (1%), Tween-20 (0,1%), inhibidores de la proteasa (cOmplete EDTA-free). Mini, Roche Diagnostics) e inhibidores de la fosfatasa PhosStop (Roche Diagnostics). Las proteínas de los cultivos celulares se extrajeron utilizando un tampón de lisis que contenía SDS (1%) y Tris-HCl (31,5 mM, pH 6,8). Los lisados ​​de proteínas se sonicaron con Branson Sonifier® S-150D (Emerson Electric Co. St. Louis, MO), se centrifugaron a 15 000 G durante 20 min y el sobrenadante se almacenó a -70 °C. La SDS-PAGE y la inmunotransferencia se realizaron con geles Criterion TGX y membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) Trans-Blot Turbo (Bio-Rad) en el sistema de transferencia semiseca Trans-Blot Turbo (Bio-Rad). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-fosfo-Smad2 (Ser465/467, Cat # 3108, Cell Signaling), anti-Smad2/3 (Cat # 3102, 8685, Cell Signaling), ambos diluidos 1:1000 en leche al 5%, anti-TGFb (Ab92486, Abcam) 1:1000, caseína al 1 %, anti-LAP (AF-246, R&D Systems) 1:1000 en leche al 5 % en condiciones no reductoras, anti-LTBP1 (n.° de cat. MAB-388, R&D Systems) diluido 1:1000 en leche al 5 % en condiciones no reductoras, anti-α-SMA (Cat # A5228, Sigma) diluido 1:10 000 en leche al 5 %, anti-OPN (Ab181440, Abcam) 1:1000 en 1 % de leche, anti-GAPDH (n.º de cat. sc-32233, Santa Cruz Biotechnology) diluido 1:1000 en 5 % de leche, anti-ADAMTSL3 (HPA034773, Atlas Antibodies) 1:1000 en 1 % de caseína y anti-ADAMTSL3 (en -anticuerpo policlonal casero producido en conejo) 1:1000 en caseína al 1%. Se utilizaron anticuerpos secundarios para ratón o conejo (1:2000, Santa Cruz Biotechnology). Se usó el reactivo de detección de transferencia Western ECL Prime (Amersham) para la detección secundaria de anticuerpos y la proteína total se detectó usando la tinción de proteínas Revert 700 (Licor). Se tomaron imágenes de fluorescencia o quimioluminiscencia usando el sistema de imágenes de transferencia Western Azure 600 (Azure Biosciences). Las bandas de proteínas se cuantificaron utilizando ImageJ 1.53c (NIH). Las membranas de transferencia Western completas utilizadas para los cálculos se muestran en Transferencias complementarias en la Información complementaria.

Las diferencias estadísticas se probaron utilizando Prism 8.3.0 (GraphPad). Los datos se presentan con media ± error estándar de la media (SEM). La distribución de los datos se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Al comparar dos grupos normalmente distribuidos, se aplicó la prueba t de Student para datos no apareados. Al comparar múltiples grupos, se aplicó ANOVA unidireccional con las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey o Dunnett. Para la comparación de múltiples puntos de tiempo, se utilizó el ANOVA de medidas repetidas de dos vías con la corrección de Geisser-Greenhouse. Para la comparación de las curvas de supervivencia se realizó la prueba Log-rank (Mantel-Cox). Los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los valores de p se informan como valores exactos o, para los datos del modelo de ratón, la importancia se da como símbolos que representan *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 para AB frente a simulado y $p < 0,05, $$p < 0,01 y $$$p < 0,001 para L3-KO AB frente a WT AB. Para los datos de RNA-seq, se consideró que los valores de RPKM ≥ 1,0 estaban por encima del ruido y los genes con ≥ 1,0 en cuatro o más muestras se consideraron detectables en este conjunto de datos. Se utilizó la corrección de Benjamini-Hochberg para pruebas múltiples y FDR de 0,05. El análisis de enriquecimiento funcional para los términos GO y las vías KEGG se realizó en el asistente de análisis de la base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado (DAVID) v6.849 (consultado el 27.08.21), y se utilizó IPA de Qiagen para la predicción de los reguladores ascendentes. Todos los experimentos de cultivo celular se realizaron como mínimo tres veces, lo que representa tres réplicas biológicas, es decir, rondas de aislamiento para células primarias o puntos de tiempo de siembra separados para CFB fetales humanos, cada experimento con dos o más réplicas técnicas. Los experimentos con ratones in vivo se realizaron en tres cohortes separadas. Se recolectaron dos cohortes a la semana y una cohorte a las seis semanas. El n de cada experimento se proporciona en las leyendas de las figuras respectivas, con n = 3–12 en cada grupo para cada análisis.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de RNA-seq utilizados para generar los gráficos y gráficos de la Fig. 3 se cargan en los Datos complementarios 1 y se depositaron en su totalidad en el Archivo europeo de nucleótidos (ENA, EMBL-EBI, Wellcome Genome Campus, Hinxton, Cambridgeshire, Reino Unido). ), acceso: PRJEB47017. Todos los datos de origen numéricos utilizados para generar las cifras principales se cargan Datos complementarios 2. Las imágenes de transferencia Western sin editar utilizadas para generar cifras se presentan en Transferencias complementarias en la Información complementaria. Todos los demás datos están disponibles del autor correspondiente a petición razonable.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Noruega; el Fondo para la Promoción de la Ciencia de Anders Jahre; la Autoridad Regional de Salud del Sureste; la Fundación Kristian Gerhard Jebsen; Becas internas de investigación estratégica del Hospital Universitario de Akershus; la Fundación Blix para el Fomento de la Investigación Médica; y el Fondo para la Ciencia de Olav Raagholt y Gerd Meidel Raagholt, Noruega a [IGL]; el Programa de Investigador Distinguido de Allen, a través del apoyo brindado por The Paul G. Allen Frontiers Group, la Fundación Marfan y la Asociación Estadounidense del Corazón a [SSA]; un premio del Programa de Jóvenes Talentos de la Fundación Holandesa del Corazón de la Iniciativa de Investigación Cardiovascular de los Países Bajos (CVON), consorcios RECONNECT [ELR]; la Alianza Cardiovascular Holandesa, CVON She-PREDICTS, subvención 2017-21, Double Dosis, 2020-B005, FWO G091018N y FWO G0B5930N a [SH]; y el Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI18/01469, PI21/00946 y CB16/11/00483), proyectos cofinanciados por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional a [AG]. Agradecemos a Almira Hasic y Dina Behmen en el Instituto de Investigación Médica Experimental y al personal del centro de animales KPM Ullevål en el Hospital Universitario de Oslo por su excelente asistencia técnica.

Instituto de Investigación Médica Experimental, Hospital Universitario de Oslo y Universidad de Oslo, Oslo, Noruega

Karoline B. Rypdal, A. Olav Melleby, Jia Li, Sheryl Palmero, Kristine Andreassen, Ivar Sjaastad, Theis Tønnessen, Mathis K. Stokke, William E. Louch, Geir Christensen e Ida G. Lunde

División de Diagnóstico y Tecnología, Hospital Universitario Akershus, Lørenskog, Noruega

Karoline B. Rypdal e Ida G. Lunde

Centro KG Jebsen de biomarcadores cardíacos, Universidad de Oslo, Oslo, Noruega

Karoline B. Rypdal e Ida G. Lunde

Departamento de Medicina Molecular, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Universidad de Oslo, Oslo, Noruega

A. Olav Melleby

Departamento de Cardiología, Universidad de Maastricht, Escuela CARIM de Enfermedades Cardiovasculares, Maastricht, Países Bajos

emma l robinson y stephane heymans

Departamento de Ingeniería Biomédica, Instituto de Investigación Lerner de la Clínica Cleveland, Cleveland, OH, EE. UU.

Deborah E. Seifert, Daniel Martin, Catelyn Clark y Suneel S. Apte

Program of Cardiovascular Diseases, CIMA Universidad de Navarra and IdiSNA, Pamplona, Spain

Begoña López & Arantxa González

CIBERCV, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España

Begoña López & Arantxa González

Departamento de Cardiología, Hospital Universitario de Oslo Rikshospitalet, Oslo, Noruega

Christen P. Dahl

Departamento de Cirugía Cardiotorácica, Hospital Universitario de Oslo Ullevål, Oslo, Noruega

Theis Tonessen

Centro de Biología Molecular y Vascular, Departamento de Ciencias Cardiovasculares, Lovaina, Bélgica

Stephane Heymans

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Conceptualización y diseño del estudio: KBR, AOM, SSA, GC, IGL Adquisición de datos: KBR, AOM, ELR, BL, CC, JL, DES, DM, SP, KA, CPD, IS, TT, IGL Análisis e interpretación de datos: KBR , AOM, ELR, AG, JL, DM, KA, MKS, WEL, SH, SSA, IGL Borrador del manuscrito: KBR, IGL Revisión crítica: Todos los autores han aprobado la versión final del manuscrito y aceptan ser responsables de todos los aspectos de la obra.

Correspondencia a Karoline B. Rypdal.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Eve Rogers.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Rypdal, KB, Olav Melleby, A., Robinson, EL et al. Los ratones knock-out para ADAMTSL3 desarrollan disfunción cardíaca y dilatación con un aumento de la señalización de TGFβ después de una sobrecarga de presión. Comun Biol 5, 1392 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04361-1

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Recibido: 01 enero 2022

Aceptado: 09 diciembre 2022

Publicado: 20 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04361-1

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